CYP2E1對擴(kuò)張型心肌病及肥厚型心肌病的調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、目的：細(xì)胞色素氧化酶P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)參與生物體內(nèi)許多內(nèi)源性和外源性物的代謝,如乙醇、四氯化碳、丙酮和花生四烯酸等。CYP2E1主要主要分布在肝臟,在腦、肺、胃、腸、心臟等也有高表達(dá)。CYP2E1參與脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡等過程,與脂肪性肝病、糖尿病及腫瘤等疾病相關(guān)。目前,關(guān)于CYP2E1在心臟中的作用以及與心肌病的關(guān)系研究未見報道。因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了心臟特異的CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠,用于分

2、析CYP2E1基因在心臟發(fā)育過程中的作用以及對cTnTR141W轉(zhuǎn)基因擴(kuò)張型心肌病(DCM)及cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因肥厚型心肌病(HCM)小鼠的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法： cTnTR141W及cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠基因表達(dá)芯片及逆轉(zhuǎn)錄PCR和western blot檢測CYP2E1于擴(kuò)張型心肌病及肥厚型心肌病模型小鼠中的表達(dá)變化。Western blot檢測CYP2E1于野生型C57BL/6J小鼠中的時程表達(dá)變化。PCR擴(kuò)增小

3、鼠CYP2E1的cDNA序列,并將其插入α-MHC啟動子下游,構(gòu)建心臟特異轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過顯微注射法建立CYP2E1轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠,并分別與cTnTR141W及cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠雜交獲得雙轉(zhuǎn)基因小鼠。M型超聲心動圖檢測CYP2E1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠心臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能變化,并記錄其生存狀況。病理組織學(xué)染色觀察CYP2E

4、1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織學(xué)改變。分光光度法檢測CYP2E1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠心臟H2O2、丙二醛(MDA)、還原性谷胱甘肽(GSH)及總抗氧化能力(T-AOC)變化。透射電鏡觀察CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟超微結(jié)構(gòu)改變。逆轉(zhuǎn)錄PCR及和weste

5、rn blot檢測CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠心肌肥厚分子marker表達(dá)變化。Western blot檢測CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟信號分子的變化。
　　 結(jié)果： cTnTR141W及cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠基因表達(dá)芯片及逆轉(zhuǎn)錄PCR和western blot結(jié)果顯示,CYP2E1于肥厚型心肌病模型小鼠心肌中的表達(dá)上調(diào),于擴(kuò)張型心肌病模型小鼠心肌中的表達(dá)下調(diào)。CYP2E1在野生型C57BL/6J小鼠胚胎期心臟中未見表達(dá),出生后一至

6、二周表達(dá)最高,之后隨著年齡增長表達(dá)下調(diào)。建立了心臟組織特異的CYP2E1高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠,同時建立了心臟組織特異的CYP2E1×cTnTR141W及CYP2E1×cTnTR92Q兩種雜交小鼠。M型超聲心動圖結(jié)果表明CYP2E1的過表達(dá):使野生型小鼠發(fā)生DCM表型,即心腔擴(kuò)大,心壁變薄,心功能下降；使cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心臟的DCM表型更加嚴(yán)重:使cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠心臟向心衰發(fā)展,即心臟出現(xiàn)失代償性的心室腔變大,室壁變薄,

7、心功能下降。心臟組織學(xué)顯示,CYP2E1的過表達(dá)加重野生型小鼠、cTnTR141W和cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌排列紊亂、肥大及間質(zhì)纖維化程度。至5月齡,CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠死亡率為8％；cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠死亡率為16％；CYP2E1×cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠死亡率為48％；cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠死亡率為4％；CYP2E1×cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠死亡率為20％。電鏡檢測顯示CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟肌纖維粗細(xì)

8、不均一,肌漿網(wǎng)擴(kuò)張,溶酶體增多,線粒體腫脹并伴有脊斷裂。RT-PCR及western blot結(jié)果表明CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟心肌細(xì)胞肥大分子標(biāo)志物,包括肌小節(jié)蛋白基因Myot、Cnn1,細(xì)胞骨架蛋白基因Acta1,細(xì)胞外基質(zhì)基因Colla1、Col3a1,信號傳導(dǎo)相關(guān)基因Nppa及Nppb均表達(dá)增加。分光光度法檢查結(jié)果表明CYP2E1的過表達(dá)可增加野生型小鼠、cTnTR141W和cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中H2O2和MDA含量,