擬盤多毛孢屬的分類及分子系統(tǒng)學(xué)和分子條形碼研究.pdf

1、擬盤多毛孢（Pestalotiopsis）普遍存在熱帶和亞熱帶地區(qū)，多數(shù)為弱致病真菌，可引致各類葉斑病，兼有對(duì)果實(shí)和采后農(nóng)產(chǎn)品為害，部分種類腐生，部分種類是植物內(nèi)生真菌的重要類群，尤其是很多木本植物重要內(nèi)生真菌。植物內(nèi)生擬盤多毛孢物種多樣性比較豐富。本文利用從廣西和浙江不同植物的莖葉中分離到的菌株、浙江農(nóng)科院和貴州大學(xué)惠贈(zèng)的擬盤多毛孢菌株開(kāi)展了擬盤多毛孢屬的分類學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)和DNA條形碼研究，并以四個(gè)DNA片段為材料用分子系統(tǒng)學(xué)方法分

2、析楊梅的病原擬盤多毛孢與內(nèi)生擬盤多毛孢之間的關(guān)系。主要取得如下結(jié)果:
　　1、根據(jù)形態(tài)特征與ITS和β-tub序列分析，將分離和收集的995株擬盤多毛孢菌鑒定為13個(gè)分類單元，分別為異色擬盤多毛孢（Pestalotiopsis versicolor）、廣布擬盤多毛孢(P.dissmeninta)、小孢擬盤多毛孢(P.microspora)、歐克安擬盤多毛孢(P.oxyanthi)、韋司梅擬盤多毛孢（P.vismiae）、長(zhǎng)毛擬盤多

3、毛孢(P.longisetula)、棒形擬盤多毛孢(P.clavispora)、甘薯擬盤多毛孢(P.batatae)、馬可羅擬盤多毛孢(P.macrochaeta)、疏毛擬盤多毛孢(P.pauciseta)、茶擬盤多毛孢（P.theae）、卡斯特尼擬盤多毛孢（P.karstenii）、杭州擬盤多毛孢（P.hangzhougensis）。
　　2、對(duì)廣西良鳳江國(guó)家森林公園蘇木科、木蘭科和桃金娘科共16種植物的內(nèi)生擬盤多毛孢多樣性進(jìn)行

4、調(diào)查。結(jié)果顯示，從蘇木科Caesalpiniaceae、木蘭科Magnoliaceae和桃金娘科Myrtaceae共16種植物中分離得到89株擬盤多毛孢，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為11個(gè)種。在調(diào)查的植物中，桃金娘科中的白千層(Melaleuca leucadendra)、假多瓣蒲桃(Syzygiμm polypetaloideμm)，蘇木科的銀珠(Peltophorμm tonkinense)、中國(guó)無(wú)憂花(Saraca chinensis)分離得到

5、的擬盤多毛孢種數(shù)分別為8、6和8、6種，是擬盤多毛孢定殖種類最多的植物種類;銀珠內(nèi)生擬盤多毛孢定殖率最高，為2.86％。內(nèi)生擬盤多毛孢在植物枝條的定殖率高于葉片，秋季高于其他的季節(jié)。經(jīng)比較，三科植物內(nèi)生擬盤多毛孢的多樣性指數(shù)以蘇木科最高(2.2353);桃金娘科次之(2.1635);木蘭科最低(1.8637)。
　　3、開(kāi)展單基因和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，單基因和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示， EF1-α、β-tub+EF1-

6、α組合、 ITS+β-tub+EF1-α聯(lián)合和ITS+β-tub+EF1-α+GPDH聯(lián)合都能反映擬盤多毛孢屬的系統(tǒng)演化關(guān)系。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，β-tub和EF1-α聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上主要進(jìn)化分枝與形態(tài)特征的對(duì)應(yīng)關(guān)系最好，該系統(tǒng)樹(shù)根據(jù)進(jìn)化分枝的演化關(guān)系，將擬盤多毛孢分成兩個(gè)分支，反映擬盤多毛孢分生孢子有色胞的兩種顏色類型即淡色（褐色至橄欖色）和暗色（暗褐色或煤煙色至褐色），亞分支反映分生孢子頂端附屬絲末端匙狀膨大與否、頂端附屬絲數(shù)量以及分

7、生孢子長(zhǎng)度和寬度，基部附屬絲的有無(wú)、是否分叉在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)沒(méi)有對(duì)應(yīng)關(guān)系。
　　4、在ITS、β-tub(Beta-微管蛋白基因)、EF1-α和GPDH等4個(gè)DNA片段中篩選擬盤多毛孢的條形碼。綜合兩項(xiàng)指標(biāo)即PCR和測(cè)序成功率，獲得DNA片段的容易程度從高到低的排序?yàn)镮TS(100％)=EF1-α(100％)＞β-tub(97.3％)＞GPDH(81.1％)。用BioEdit軟件對(duì)分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的平均種內(nèi)相似率和平均種間相似率進(jìn)行計(jì)算

8、，當(dāng)平均種內(nèi)相似率越大，而平均種間相似率越小，反映該序列建立的系統(tǒng)樹(shù)更能體現(xiàn)對(duì)物種的識(shí)別。從平均種內(nèi)相似率（簡(jiǎn)稱AS）來(lái)看，β-tub(AS=0.994)＞EF1-α(AS=0.990)＞GPDH(AS=0.932)＞ITS(AS=0.877)，而從平均種間相似率（簡(jiǎn)稱ASi）來(lái)看，從高到低的排序?yàn)镚PDH(ASi=0.957)＞ITS(ASi=0.884)＞EF1-α(ASi=0.860)＞β-tub(ASi=0.781)。以ITS+

9、β-tub序列組合的平均種內(nèi)相似率(AS=0.994)與ITS+EF1-α序列組合的平均種內(nèi)相似率(AS=0.992)接近，且ITS+β-tub序列組合的平均種間相似率(ASi=0.863)大于ITS+EF1-α序列組合的平均種間相似率(ASi=0.848)。以ITS+β-tub+EF1-α序列組合的平均種內(nèi)相似率(AS=0.994)與ITS+β-tub+EF1-α+GPDH序列組合的平均種內(nèi)相似率(AS=0.993)接近，而ITS+β

10、-tub+EF1-α序列組合的平均種間相似率(ASi=0.768)小于以ITS+β-tub+EF1-α+GPDH序列組合的平均種間相似率(ASi=0.783)。β-tub、ITS+β-tub組合、ITS+EF1-α組合和ITS+β-tub+EF1-α組合的平均種內(nèi)相似率(AS)和平均種間相似率(ASi)之間有一條相對(duì)比較清晰的分界線，適合作為分子條形碼，而ITS、EF1-α和GPDH以及ITS+β-tub+EF1-α+GPDH序列組合的

11、平均種內(nèi)相似率和平均種間相似率之間重疊嚴(yán)重，不太適合作為分子條形碼。根據(jù)以上計(jì)算結(jié)果， ITS能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢物種有6個(gè)物種，不能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢共計(jì)7種;β-tub能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢物種有10個(gè)物種，不能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢共計(jì)3種，EF1-α能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢物種有9個(gè)物種，不能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢有共計(jì)4種;GPDH能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢物種有5個(gè)物種;不能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢有7種，P.batatae尚缺數(shù)據(jù);ITS、β-tu

12、b、EF1-α和GPDH等4個(gè)DNA片段對(duì)擬盤多毛孢物種識(shí)別率從高到低的順序?yàn)棣?tub(76.9％)＞EF1-α(69.2％)＞ITS(46.2％)＞GPDH(38.5％)。從ITS+β-tub和ITS+EF1-α序列組合可以看出，ITS+β-tub序列組合能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢物種有11個(gè)物種;不能區(qū)分開(kāi)的物種是P.longisetula和P.versicolor。ITS+EF1-α序列組合能區(qū)分開(kāi)的擬盤多毛孢物種有9個(gè)物種;不能區(qū)分

13、開(kāi)的物種是P.longisetula、P.versicolor、P.oxyanthi和P.batatae。ITS+β-tub和ITS+EF1-α序列組合能識(shí)別的擬盤多毛孢物種分別是11種和9種;ITS+β-tub+EF1-α序列組合和ITS+β-tub+EF1-α+GPDH序列組合對(duì)擬盤多毛孢物種識(shí)別率分別是100％和92.3％。根據(jù)PCR成功率、測(cè)序成功率、平均種內(nèi)相似率、平均種間相似率以及各DNA片段及其組合對(duì)擬盤多毛孢的物種識(shí)別率

14、綜合分析，結(jié)合公用分子數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中ITS序列數(shù)據(jù)豐富，而其他序列所涉及到的物種還很有限的現(xiàn)狀，建議把ITS作為擬盤多毛孢屬的主要條形碼，β-tub作為擬盤多毛孢屬的輔助條形碼，對(duì)于個(gè)別比較難以鑒別的種類，可采取ITS+β-tub+EF1-α序列組合建立分子系統(tǒng)樹(shù)對(duì)擬盤多毛孢屬物種進(jìn)行識(shí)別。
　　5、用ITS、β-tub、EF1-α和GPDH等4個(gè)DNA片段分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)探討楊梅病原擬盤多毛孢與楊梅內(nèi)生擬盤多毛孢菌