文昌魚(yú)肽聚糖識(shí)別蛋白基因的表達(dá)及功能.pdf

1、肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP)是重要的先天性免疫基因家族，它能夠有效地識(shí)別入侵病源細(xì)菌并啟動(dòng)免疫反應(yīng)。PGRP已在軟體動(dòng)物、昆蟲(chóng)、棘皮動(dòng)物以及包括人類(lèi)在內(nèi)的脊椎動(dòng)物中獲得鑒定。盡管這些PGRP在進(jìn)化過(guò)程中，結(jié)構(gòu)上十分保守，但是無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的PGRP在免疫功能上具有明顯的差異。作為介于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間的過(guò)渡類(lèi)型，關(guān)于文昌魚(yú)的PGRP我們?nèi)匀恢跎?。本論文從文昌魚(yú)(Branchiostoma japonicus)中克隆得到了一

2、個(gè)短型的PGRP基因，并對(duì)它的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及功能進(jìn)行了研究。
　　 我們?cè)谖牟~(yú)中克隆了一個(gè)全長(zhǎng)為895 bp的PGRP-S cDNA，該cDNA包含一個(gè)長(zhǎng)度為753 bp的開(kāi)放閱讀框，5’非翻譯區(qū)長(zhǎng)18 bp，3’非翻譯區(qū)長(zhǎng)124 bp，編碼一個(gè)250個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測(cè)的分子量大約為26.5 kDa，利用SignalP3.0和TMHMM2.0分析得到其氨基端具有18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，并且序列中不存在穿膜螺旋結(jié)構(gòu)，因此推測(cè)PGR

3、P-S是一種分泌型的蛋白。與其他短型PGRP進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，文昌魚(yú)PGRP-S同樣具有羧基端保守的PGRP結(jié)構(gòu)域，并帶有T7噬菌體酰胺酶活性及Zn2+結(jié)合所必需的H116-Y151-H225-T231-C233活性位點(diǎn)。但在它的氨基端具有ChtBD1結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域在其他已知的PGRP中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，表明文昌魚(yú)PGRP-S是短型PGRP家族中新成員?；蚪MDNA和cDNA的比較得出，文昌魚(yú)PGRP-S基因全長(zhǎng)2640 bp，具有6個(gè)外

4、顯子和5個(gè)內(nèi)含子。文昌魚(yú)的前兩個(gè)外顯子在無(wú)脊椎動(dòng)物及脊椎動(dòng)物中都未找到高同源性的結(jié)構(gòu)，這與文昌魚(yú)PGRP-S是短型PGRP家族中新成員的結(jié)論相一致。文昌魚(yú)pgrp-s基因的表達(dá)具有組織特異性，其mRNA主要在肝盲囊、后腸和肌肉中表達(dá)。pgrp-s主要在肝盲囊和后腸中表達(dá)為消化系統(tǒng)是文昌魚(yú)免疫系統(tǒng)的中心提供了又一個(gè)的證據(jù)。為了深入了解文昌魚(yú)PGRP-S的功能以及ChtBD1結(jié)構(gòu)域與PGRP結(jié)構(gòu)域之間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，我們重組表達(dá)了文昌魚(yú)P

5、GRP-S的成熟蛋白(除去信號(hào)肽)rPGRP-S和截短的蛋白(除去ChtBD1結(jié)構(gòu)域)rP86/250用于功能分析。rPGRP-S和rP86/250能同Lys-type PGN、Dap-type PGN和幾丁質(zhì)結(jié)合。刪除ChtBD1結(jié)構(gòu)域并不影響對(duì)幾丁質(zhì)的結(jié)合。兩種蛋白也能和S.aureus，E.coli，和P.pastoris結(jié)合，這表明同昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物的PGRP一樣，文昌魚(yú)PGRP-S是一種廣泛的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別細(xì)菌S.aur

6、eus和E.coli以及真菌P.pastoris。rPGRP-S和rP86/250能夠水解Lys-type PGN和Dap-type PGN，并且Lys-typePGN為最適底物。這些結(jié)果表明rPGRP-S和rP86/250具有酶活性，這種酶活性不依賴(lài)于ChtBD1結(jié)構(gòu)域。另外，rPGRP-S和rP86/250都具有抑菌活性，能夠殺死細(xì)菌S.aureus和E.coli以及真菌P.pastoris。刪除ChtBD1結(jié)構(gòu)域可使抑制真菌的能力

7、大大降低，這表明抑菌能力可能是所有脊索動(dòng)物所具有的共同特征。
　　 PGRP結(jié)構(gòu)域可以被其間一些保守性相對(duì)較低的區(qū)域分隔成PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)之間都是高度保守的。然而這些亞結(jié)構(gòu)域的功能仍然不是很清楚。為了進(jìn)一步研究三個(gè)亞結(jié)構(gòu)域的功能，我們表達(dá)了rP120/250(除去PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅲ)和rP174/250(除去PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ，僅保留結(jié)構(gòu)域Ⅰ)進(jìn)行功能分析。rP120/250和r

8、P174/250仍然保持了對(duì)兩種PGNs和幾丁質(zhì)的高結(jié)合能力，并仍然能結(jié)合細(xì)菌S.aureus和E.coli以及真菌P.pastoris，但對(duì)S.aureus和P.pastoris結(jié)合能力都出現(xiàn)了降低。rP120/250和rP174/250均失去了對(duì)PGNs的酰胺酶活性，這表明完整的PGRP結(jié)構(gòu)域是酰胺酶活性所必須的結(jié)構(gòu)。刪除了PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅱ的重組蛋白rP120/250和rP174/250仍然對(duì)大腸桿菌就有較強(qiáng)的抑制作用，并呈現(xiàn)劑