基于人蛋白質(zhì)組芯片的新O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶相互作用蛋白及底物發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、O-GlcNAc糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式,參與了許多重要的生物學(xué)過(guò)程。O-GlcNAc糖基化的異常與多種重要疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前已鑒定的O-GlcNAc糖基化的蛋白有1000多種,但是在人細(xì)胞中催化O-GlcNAc糖基化反應(yīng)的卻只有β-N-acetylglucosaminyl Transferase(OGT)一種酶(三種結(jié)構(gòu),分別為ncOGT, mOGT, sOGT),底物數(shù)目與酶數(shù)目之間存在如此大的反差,這里面的

2、一個(gè)重要問(wèn)題是一個(gè)單一的酶是如何有效地修飾如此眾多功能各異的底物蛋白質(zhì)的?有觀點(diǎn)認(rèn)為 OGT通過(guò)與不同的蛋白輔助因子結(jié)合形成具有底物特異性全酶來(lái)實(shí)現(xiàn)特異性的蛋白糖基化。但目前所報(bào)道的OGT相互作用蛋白只有三十多種,且全部為ncOGT的相互作用蛋白,數(shù)量如此之少的OGT相互作用蛋白質(zhì)遠(yuǎn)不足以滿(mǎn)足成千上萬(wàn)的O-GlcNAc糖基化底物,OGT的底物特異性到到底是如何決定的?同時(shí)由于O-GlcNAc糖基化在細(xì)胞內(nèi)是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程,與蛋白質(zhì)磷

3、酸化相似。在人體細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)的O-GlcNAc糖基化蛋白的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于已知的磷酸化的蛋白質(zhì)數(shù)目,因此我們有理由相信,可能有更多的O-GlcNAc糖基化蛋白質(zhì)有待發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)新興的蛋白質(zhì)組芯片技術(shù)因其具有高通量、微型化、平行快速等優(yōu)點(diǎn)為我們系統(tǒng)性的研究生物學(xué)問(wèn)題提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。
　　本研究結(jié)合人蛋白質(zhì)組芯片的優(yōu)勢(shì),可以系統(tǒng)的篩查出人體內(nèi)與ncOGT相互作用的蛋白和糖基化底物。最終我們從芯片上篩選出了29個(gè)與ncOGT相互作用的

4、蛋白,將這29個(gè)蛋白進(jìn)行一些生物信息學(xué)如PANTHER(Protein Analysis Through Evolutionary Relationships)等分類(lèi)分析。生物信息學(xué)的結(jié)果分析顯示這些蛋白參與多種生命活動(dòng),主要集中在高爾基內(nèi)介導(dǎo)的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)和維生素的生物合成。接著從29個(gè)蛋白中選出6個(gè)具有重要意義的蛋白進(jìn)行體內(nèi)Co-IP和體外動(dòng)力學(xué)分析,結(jié)果顯示PSAT1和HAAO與ncOGT之間存在著明顯的相互作用。同時(shí)我們也檢測(cè)到PS

5、AT1和HAAO在體內(nèi)均是被O-GlcNAc糖基化的。對(duì)ncOGT, sOGT進(jìn)行了酶活實(shí)驗(yàn)的測(cè)定,基于芯片的高通量性,用OGT小肽底物點(diǎn)制成小肽芯片,然后進(jìn)行芯片酶活反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)在體外條件下只有sOGT有酶活,隨后我們對(duì)sOGT的酶活反應(yīng)條件進(jìn)行了一些列的優(yōu)化,最后確定出了sOGT體外反應(yīng)的最佳體系。在今后的工作中我們可以考慮將sOGT的酶活反應(yīng)轉(zhuǎn)移到人的全基因組蛋白芯片上,從而系統(tǒng)的篩查人體內(nèi) O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白,結(jié)合前