GP73抗體修飾陽離子脂質體介導HSV-tk基因對肝癌細胞的選擇性殺傷作用研究.pdf

1、目的：
　　1.篩選肝癌細胞和其他非肝癌細胞表面高爾基體膜蛋白73（GP73）陽性表達率，確定GP73在肝癌細胞表面表達的特異性；
　　2.制備普通陽離子脂質體；
　　3.將普通陽離子脂質體(lipoplexes)與GP73抗體偶聯(lián)，構建一種新型的由GP73抗體修飾的能夠特異性結合肝癌細胞的靶向治療載體；
　　4.制備不同劑量的GP73抗體修飾脂質體，轉染HepG2肝癌細胞，流式細胞術篩選轉染率最高的GP73抗體

2、修飾組，確定脂質體中GP73抗體的最佳負載量；
　　5.比較GP73抗體修飾的脂質體和普通陽離子脂質體對人肝癌細胞株HepG2、Bel-7402、SMMC-7721和人正常肝細胞HL-7702以及人非肝癌細胞SW480和正常人胚腎細胞HEK293T的轉染效率；
　　6.研究由GP73抗體修飾的陽離子脂質體介導的HSVtk自殺基因聯(lián)合更昔洛韋（GCV）對肝癌細胞的體外殺傷作用；
　　7.研究由GP73抗體修飾的陽離子脂質

3、體介導的HSVtk自殺基因聯(lián)合GCV對肝癌荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤的殺傷作用。
　　方法：
　　1.用GP73的一抗(Anti-GOLPH2）連接二抗FITC分別孵育細胞HepG2、SMMC-7721、Bel-7402、HL-7702、Hela、SW480和HEK293T，通過流式細胞儀檢測細胞表面GP73的陽性表達率。
　　2.乙醇注入法和擠壓法聯(lián)合制備普通陽離子脂質體（實驗室前期制備方法）。
　　3.將GP73抗體與

4、陽離子脂質體偶聯(lián)，制備GP73抗體修飾的脂質體。
　　4.將普通陽離子脂質體和GP73抗體修飾脂質體分別與pGenesil-1質粒混勻、孵育，確定最佳的包裹比例。
　　5.制備含量不同的GP73抗體修飾的陽離子脂質體，轉染HepG2肝癌細胞，流式細胞術篩選轉染率最高的GP73抗體修飾脂質體組，確定脂質體中GP73的最佳負載量。
　　6.分別使用GP73抗體修飾的陽離子脂質體轉染pGenesil-1質粒，流式細胞儀檢測H

5、epG2、Bel-7402、SMMC-7721、HL-7702、Hela、SW480、HEK293T細胞的報告基因綠色熒光蛋白（EGFP）的表達。
　　7.用GP73抗體修飾的陽離子脂質體攜帶pSurvivin-TK-PBI-CMV2質粒分別轉染細胞HepG2、Bel-7402和HL-7702，48小時后提取細胞的總RNA和總蛋白，并通過RT-PCR、Westernblot技術方法檢測細胞中HSVtk基因的mRNA和蛋白表達水平。

6、
　　8.用GP73抗體修飾的陽離子脂質體攜帶pSurvivin-TK-PBI-CMV2質粒分別轉染肝癌細胞HepG2、Bel-7402和肝正常細胞HL-7702，加入濃度為150μg/mL的前體藥物GCV處理24 h,經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　9.梯度劑量的GCV處理轉染后的肝癌細胞48小時，MTT法檢測HSVtk自殺基因系統(tǒng)對肝（癌）細胞生存率的影響情況。
　　10.用生長狀態(tài)良好的HepG2肝癌細胞接種

7、裸鼠成瘤，利用公式V=ab2/2，(a代表瘤體最長徑，b代表瘤體最短徑)計算瘤體積。
　　11. HE染色檢測干預后三組腫瘤組織壞死情況。
　　12. TUNEL凋亡試劑盒檢測干預后三組腫瘤組織細胞凋亡情況。
　　13.裸鼠開始治療后，觀察裸鼠生長狀態(tài)，并持續(xù)40天記錄裸鼠存活狀態(tài)，用Graphpad Prism v6.0軟件分析數(shù)據(jù)，繪制生長曲線圖譜，比較三組荷瘤裸鼠生存期。
　　結果：
　　1.通過對細

8、胞表面GP73陽性表達率的篩選，肝癌細胞HepG2、Bel-7402、SMMC-7721細胞表面GP73陽性率高于HL-7702、Hela、SW480、HEK293T，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明了GP73在肝癌細胞表面表達有特異性；
　　2.制備了一種普通陽離子脂質體；
　　3.制備了一種GP73抗體修飾的能夠特異性結合肝癌細胞的靶向治療載體（Anti GP73-lipoplexes）；
　　4. GP73

9、抗體修飾的脂質體對人肝癌細胞株HepG2、Bel-7402和SMMC-7721的轉染效率明顯高于肝正常細胞和非肝癌細胞（P<0.05）；
　　5.基因和蛋白水平檢測表明，HSVtk基因在HepG2和Bel-7402肝癌細胞中有表達，而在肝正常細胞HL-7702中未見表達；
　　6.細胞增殖實驗（MTT）結果可見，HepG2和Bel-7402肝癌細胞轉染組在GCV濃度不斷增加的情況下，細胞存活率不斷下降，與未轉染加藥組和正常肝

10、細胞HL-7702相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；
　　7.流式細胞儀(FC500)檢測凋亡結果表明HepG2、Bel-7402肝癌細胞死亡率明顯高于肝正常細胞組（P<0.05）；
　　8.肝腫瘤裸鼠造模成功，腫瘤體積達160~200 mm3；
　　9.免疫組化和TUNEL檢測腫瘤組織細胞凋亡結果表明，Anti GP73-lipoplexes運載HSVtk基因聯(lián)合GCV治療組腫瘤組織細胞凋亡明顯，而lipoplexe

11、s+HSVtk+GCV組有少量細胞凋亡，空載組(lipoplexes+Vector+GCV)幾乎未見凋亡細胞；
　　10.生存曲線分析表明Anti GP73-lipoplexes+HSVtk+GCV治療組裸鼠生存期明顯長于對照組（P<0.05）。
　　結論：
　　1.肝癌細胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721表面GP73陽性表達率高于肝正常細胞和非肝癌細胞。
　　2. GP73修飾的陽離子脂質體(G

12、P73-lipoplexes)載體運輸系統(tǒng)成功構建。
　　3. Anti GP73-lipoplexes對肝癌細胞具有較高的轉染效率。
　　4. Anti GP73-lipoplexes介導自殺基因真核表達質粒pSurvivin-TK-PBI-CMV2在GP73陽性高表達的HepG2、Bel-7402肝癌細胞內(nèi)成功表達。
　　5.在細胞水平：Anti GP73-lipoplexes介導SUR啟動子調控的HSVtk/GC