松花粉多糖的熒光標記及其與細胞TLR4的作用.pdf

1、本實驗室最近兩年對松花粉多糖的研究主要集中在脂肪細胞、癌細胞和免疫細胞等方面。其中針對免疫細胞的研究又包括T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞的增殖及鈣離子相關的信號通路之間的研究。
　　雖然本實驗室已完成了較多的工作，但是在馬尾松花粉多糖與細胞的具體的作用是在細胞內還是細胞外仍然不是十分明確。另外，由于松花粉多糖分子無發(fā)光的基團、在細胞內作用復雜等原因，上述問題的研究比較困難。鑒于這些原因，本次實驗確定將馬尾松花粉多糖進行熒光標記后

2、再探討其與細胞的作用。
　　本文主要包括以下內容：
　　一、對馬尾松花粉粗多糖進行提取，本次實驗采用本實驗室比較成熟且一直使用的熱水浸提法。然后將去除蛋白的粗多糖用20％、40%、60%、80%濃度的乙醇分級沉淀。其中，活性較好的60%乙醇沉淀的粗多糖是本此實驗所需多糖，命名為 PPM60。
　　二、對PPM60進行熒光標記。第一步，PPM60與酪胺反應生成的PPM60-Tyr用凝膠柱 Sephacryl S-400H

3、R進行層析，用紫外分光光度計能夠280nm下測得較強的吸收峰。第二步，PPM60-Tyr與FITC的反應，生成物命名PPM60-Tyr-FITC，生成的PPM60-Tyr-FITC再用Sephacryl S-400HR層析，層析的結果用紫外分光光度計、熒光分光光度計測FITC的吸收峰，用苯酚-硫酸法測多糖的吸收峰，最后對比，在前30管內有兩個峰符合要求命名為峰1和峰4。之后再用 Sephacryl S-400HR層析柱分別對這兩個峰純化

4、2-3次。純化后的峰1和峰4分別計算取代度為4.32%和0.66%，都達到了后期使用流式細胞儀等機器檢測時對靈敏度的要求。經過檢測的結果的分析表明本次熒光標記實驗是成功的。
　　三、研究PPM60-Tyr-FITC對細胞增殖作用的影響。鑒于上述試驗中所得的峰1的熒光強度高于峰4，所以選取峰1開展研究。結果表明PPM60-Tyr-FITC對細胞的活性影響不大，滿足作用于細胞的實驗要求，其中400μg/mL的PPM60-Tyr-FIT

5、C為最適濃度。
　　四、研究PPM60-Tyr-FITC與巨噬細胞RAW264.7的受體TLR4的作用。使用流式細胞儀和激光掃描共聚焦顯微鏡等設備，檢測標準品FITC-dextran和PPM60-Tyr-FITC與細胞作用的情況。結果表明FITC-dextran和PPM60-Tyr-FITC都能隨著時間的增加由外而內的進入細胞。用抑制劑抑制關鍵內吞相關蛋白及受體的作用的實驗結果表明，網格蛋白及TLR4在FITC-dextran和P