rhIFN-α1b對(duì)RSV感染鼠肺病變及JAK-STAT和TLR4-NF-κB信號(hào)通路的影響.pdf

1、呼吸道合胞病毒（RSV）是全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒肺炎、毛細(xì)支氣管炎等下呼吸道感染的重要病原體，可引起或加重兒童哮喘，是嬰幼兒住院的主要病因，嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致死亡。RSV也可引起成人嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，特別是老年人及免疫缺陷病患者。目前臨床上尚無(wú)特異性針對(duì)其的抗病毒藥物，所以開(kāi)發(fā)研究新的治療RSV藥物及疫苗已成為全球迫在眉睫的需要。
　　重組人干擾素α1b（rhINF-α1b）抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等作用已被越來(lái)越多的學(xué)者研究證實(shí)，最近其作

2、用于 RSV的研究被積極開(kāi)展，前期我們已有部分實(shí)驗(yàn)表明rhINF-α1b對(duì)RSV的抗病毒作用，但其作用機(jī)制尚不明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道JAK/STAT、TLR4/NF-κB等信號(hào)通路與RSV感染有密切的相關(guān)性。因此，我們推測(cè)這些信號(hào)通路與RSV感染的致病機(jī)制及rhINF-α1b干預(yù)治療的效果可能有著一定的相關(guān)性。
　　目的：
　　本課題通過(guò)rhINF-α1b不同劑量的霧化吸入給藥及腹腔注射給藥，采用光鏡下觀察病理學(xué)改變、免疫熒光法觀

3、察STAT1、STAT2蛋白的表達(dá)及免疫組化法觀察TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)，探討rhINF-α1b不同劑量及給藥方式對(duì)RSV感染小鼠的抗病毒作用及對(duì)JAK/STAT和TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響。
　　方法：
　?。?）Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、計(jì)數(shù)及凍存。
　?。?）RSV病毒增殖，并收集病毒懸液。
　?。?）提取病毒懸液RNA，檢測(cè)病毒RNA純度及完整性。
　?。?）RT-PCR鑒定RSV核

4、酸，檢測(cè)病毒TCID50。
　　（5）將48只BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組（每組8只）：陰性對(duì)照組，RSV感染模型組，rhINF-α1b12.5μg霧化吸入組，rhINF-α1b25μg霧化吸入組，rhINF-α1b50μg霧化吸入組，rhINF-α1b12.33μg/kg腹腔注射組。
　?。?）除陰性對(duì)照組小鼠外，對(duì)其余各組小鼠進(jìn)行RSV病毒懸液滴鼻，建立RSV小鼠感染模型。
　　（7）連續(xù)5天藥物干預(yù)治療，于第6天

5、無(wú)菌剖取小鼠左肺組織，于4％甲醛溶液中固定48h,石蠟包埋，切片。
　?。?）通過(guò)HE染色切片，在光鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變。
　?。?）通過(guò)免疫熒光染色，在免疫熒光顯微鏡下觀察STAT1和STAT2蛋白表達(dá)情況。
　?。?0）通過(guò)免疫組化法染色，在光鏡下觀察TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　?。?）Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)，RSV病毒懸液收集成功，純度及完整性較好，RSV核酸鑒定明確，T

6、CID50=10-4.3。
　?。?）成功建立RSV感染小鼠模型。
　?。?）光鏡下觀察，RSV感染模型組小鼠肺組織炎性損傷明顯。在rhINF-α1b干預(yù)治療后，各組炎性損傷均有不同程度的改善，其中rhINF-α1b50μg霧化吸入組炎性損傷程度最輕；病理組織學(xué)評(píng)分各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）免疫熒光顯微鏡下觀察，RSV感染模型組STAT1和STAT2蛋白表達(dá)明顯減弱，rhINF-α1b干預(yù)治

7、療后可不同程度提高因 RSV感染而受到抑制的 STAT1和STAT2蛋白表達(dá)，rhINF-α1b50μg霧化吸入組STAT1和STAT2蛋白表達(dá)提高最顯著，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）光鏡下觀察RSV感染模型組TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，rhINF-α1b干預(yù)治療后可不同程度下調(diào)因 RSV感染而激活的TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)，rhINF-α1b50μg霧化吸入組STAT1和STAT2蛋白表達(dá)

8、下調(diào)最顯著，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）光鏡下觀察rhIFN-α1b不同劑量的霧化吸入和腹腔注射均可改善RSV感染小鼠的肺組織炎性損傷，提示rhIFN-α1b對(duì)RSV感染小鼠具有抗病毒作用。
　?。?）RSV感染的小鼠肺組織細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化，而JAK/STAT信號(hào)通路的活性被抑制。給予外源性rhINF-α1b可抑制因受RSV感染激活的TLR4/NF-κB信號(hào)

9、通路，提高因受RSV感染抑制的JAK/STAT信號(hào)通路活性。在本實(shí)驗(yàn)中，給予外源性rhINF-α1b劑量越大，上述通路的信號(hào)變化越明顯，肺組織炎性損傷越小。提示rhIFN-α1b對(duì)RSV感染小鼠具有抗病毒作用并與rhIFN-α1b調(diào)節(jié)上述信號(hào)通路的信號(hào)變化有關(guān)。
　　（3）rhINF-α1b霧化吸入對(duì)RSV感染小鼠治療效果，優(yōu)于腹腔注射。
　?。?）rhINF-α1b霧化吸入劑量對(duì)RSV感染小鼠治療效果和上述通路的信號(hào)變化的