KHDRBS家族對前列腺癌細(xì)胞表型及雄激素受體的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與抑癌基因突變、DNA修復(fù)基因失活及原癌基因異常激活密切相關(guān)，有多種信號通路參與?；虻倪x擇性剪接調(diào)控在前列腺癌中發(fā)揮重要作用，對于前列腺癌至關(guān)重要的雄激素受體（androgen receptor，AR）受剪接調(diào)控能夠產(chǎn)生多種異構(gòu)體，其中AR-V7和AR-V567es參與前列腺癌耐受內(nèi)分泌治療并進(jìn)展為去勢抵抗前列腺癌的過程。研究發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白KHDRBS1能夠協(xié)助

2、剪接小體識別AR外顯子3b并完成剪接最終形成AR-V7，而且KHDRBS1異常促進(jìn)包括前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤進(jìn)展并與臨床分期、病理分級和患者預(yù)后等臨床指標(biāo)正相關(guān)。KHDRBS1基因有兩個(gè)同源且高度保守的亞家族成員，KHDRBS2和3，二者與KHDRBS1在RNA結(jié)合功能域KH域有70％～80％的氨基酸序列一致，并且與KHDRBS1存在交互作用，同時(shí)與乳腺癌、腎癌等也有關(guān)聯(lián)。但KHDRBS2和3在前列腺癌中的作用研究仍屬空白。本課題中

3、對KHDRBS家族在PCa進(jìn)展中的作用，特別是KHDRBS2和3對前列腺癌細(xì)胞的作用以及與AR及AR剪接異構(gòu)體的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)探討，以增加對KHDRBS家族的認(rèn)識，豐富前列腺癌發(fā)生進(jìn)展的分子機(jī)制研究。
　　研究目的:
　　1.明確KHDRBS家族基因在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平;
　　2.明確KHDRBS2和3在前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及細(xì)胞周期中的作用;
　　3.明確KHDRBS2和3間的相互關(guān)系;
　

4、　4.明確KHDRBS家族與AR、AR-V7和AR-V567es的關(guān)系。
　　研究方法和結(jié)果:
　　一、KHDRBS家族在前列腺癌中的生物信息學(xué)分析及在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)驗(yàn)證
　　方法:1）應(yīng)用cBioPortal在線工具對來自于TCGA等11個(gè)研究計(jì)劃的前列腺癌樣本集合的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，總結(jié)KHDRBS家族基因在樣本集合中基因改變的比例、表達(dá)水平以及與總生存及無病生存期的關(guān)系;2）應(yīng)用Real-time PCR檢測

5、前列腺癌細(xì)胞系22RV1、LnCap、DU145和PC3細(xì)胞mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1）基于cBioPortal調(diào)用的11個(gè)樣本集合，與KHDRBS1相比，KHDRBS2和3在PCa樣本集合中的基因改變發(fā)生更為廣泛，并且KHDRBS3能夠影響樣本集合中患者的總生存，提示KHDRBS2和3可能與PCa發(fā)生發(fā)展相關(guān)。2）樣本均為去勢抵抗性前列腺癌及去勢抵抗性神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌的NEPC樣本集合中，KHDRBS1，2和3基因發(fā)生改

6、變的樣本比例最高，提示KHDRBS家族可能與去勢抵抗性前列腺癌進(jìn)展有關(guān)。3）KHDRBS1在22RV1、LnCap、DU145和PC3中均有表達(dá)。22RV1細(xì)胞中KHDRBS2高表達(dá)，KHDRBS3低表達(dá);而PC3細(xì)胞中KHDRBS2低表達(dá)，KHDRBS3高表達(dá)。提示二者的表達(dá)具有細(xì)胞類型特異性。
　　二、KHDRBS2和3對前列腺癌細(xì)胞的作用
　　方法:1）應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)及慢病毒轉(zhuǎn)染敲減改變KHDRBS2和3在22RV

7、1和PC3細(xì)胞中的表達(dá)水平，并應(yīng)用Muse細(xì)胞儀、Transwell法及CCK-8法和體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞的細(xì)胞周期、遷移、侵襲及體外和體內(nèi)的增殖能力。2）同前法改變KHDRBS2和3在22RV1和PC3細(xì)胞中的表達(dá)水平，應(yīng)用Real-time PCR及Western-Blot檢測對應(yīng)細(xì)胞中KHDRBS2和3的變化，明確KHDRBS2和3在前列腺癌細(xì)胞中的關(guān)系。
　　結(jié)果:1）瞬時(shí)過表達(dá)能夠成功構(gòu)建高表達(dá)KHDRBS2和3的P

8、C3和22RV1細(xì)胞模型;2）慢病毒轉(zhuǎn)染敲減KHDRBS2或3能夠成功構(gòu)建低表達(dá)KHDRBS2的22RV1或低表達(dá)KHDRBS3的PC3細(xì)胞模型;3）敲減KHDRBS2能夠抑制22RV1細(xì)胞的增殖能力，而敲減KHDRBS3能夠抑制PC3細(xì)胞的增殖能力;4）過表達(dá)或敲減KHDRBS2后KHDRBS3在mRNA和蛋白水平的表達(dá)發(fā)生降低或增高改變，而過表達(dá)或敲減KHDRBS3之后KHDRBS2的表達(dá)水平也發(fā)生降低或增高，但改變KHDRBS2或

9、3的表達(dá)對KHDRBS1的表達(dá)水平則無影響。
　　三、KHDRBS家族與雄激素受體的關(guān)系
　　方法:1）應(yīng)用Real-time PCR檢測22RV1、LnCap、DU145和PC3細(xì)胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es的表達(dá)水平。2）應(yīng)用Real-time PCR檢測有無雄激素及AR拮抗劑的條件下，22RV1細(xì)胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es及22RV1和PC3細(xì)胞中KHDRBS1，2和3的表達(dá)水平。3）

10、應(yīng)用Real-time PCR檢測過表達(dá)KHDRBS2和3及敲減KHDRBS2的22RV1細(xì)胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es的表達(dá)水平。4)在有無雄激素的條件下，應(yīng)用Real-time PCR檢測過表達(dá)KHDRBS2和3的22RV1細(xì)胞中KHDRBS2和3的mRNA表達(dá)變化以及敲減KHDRBS2的22RV1細(xì)胞中KHDRBS2、KHDRBS3、AR和AR-V7的mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果:1）22RV1細(xì)胞中AR-F

11、L、AR-V7和AR-V567es高表達(dá);而在PC3細(xì)胞中三種AR異構(gòu)體均低表達(dá)。2）無雄激素條件下22RV1細(xì)胞中AR、AR-V7和AR-V567es及KHDRBS1和2表達(dá)水平較正常培養(yǎng)組顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，KHDRBS3雖有升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在PC3中，同樣處理對于KHDRBS家族基因的表達(dá)無影響;3）敲減KHDRBS2可顯著降低22RV1細(xì)胞中AR-V7的表達(dá)水平，P值為0.0168。4）過表達(dá)KHDRBS2和3以

12、及敲減KHDRBS2的22RV1細(xì)胞，無論是否添加雄激素，KHDRBS2、KHDRBS3、AR和AR-V7的mRNA表達(dá)變化與未做過表達(dá)和敲減的22RV1細(xì)胞對雄激素的反應(yīng)一致。
　　研究結(jié)論:
　　1.cBioPortal分析前列腺癌樣本提示KHDRBS2和3可能在前列腺癌及去勢抵抗性前列腺癌發(fā)生進(jìn)展中具有重要作用。
　　2.在22RV1和PC3細(xì)胞，KHDRBS2和3的表達(dá)具有細(xì)胞類型特異性并與AR及其異構(gòu)體表達(dá)表