高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌菌株選育及其轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化.pdf

1、γ-氨基丁酸(簡(jiǎn)稱GABA),是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有許多重要的生理功能,其作為一種新型功能性因子正廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。
　　 本文首先通過篩選、誘變得到一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌菌株,然后通過搖瓶培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化條件和5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,進(jìn)一步提高了其γ-氨基丁酸的產(chǎn)量。具體內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 首先,從樣品中篩選到一株高產(chǎn)GABA菌株01,對(duì)菌株01進(jìn)行形態(tài)學(xué)和常規(guī)生理生化

2、鑒定實(shí)驗(yàn)及16S rDNA基因序列分析,比對(duì)結(jié)果表明,菌株01與Lactobacillusplantarum strain EW-p的16S rDNA序列相似性最高,為99％,且與生理生化特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,因此確定菌株01為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),將其命名為L(zhǎng)P-GB01。以LP-GB01為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外誘變處理,以GABA梯度平板篩選到一株高產(chǎn)GABA的突變株LP-GB01-21。該誘變菌株以

3、80 g/L的L.谷氨酸為底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,24 h后GABA含量達(dá)到51.9 g/L,與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了55.39％。該高產(chǎn)突變株LP-GB01-21已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC M209102。
　　 其次,在搖瓶水平上考察了碳氮源、酵母粉及無機(jī)鹽等培養(yǎng)條件對(duì)LP-GB01-21菌體生長(zhǎng)和GABA產(chǎn)率的影響,確定種子培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10 g/L,蛋白胨15 g/L、酵母粉10 g/L、丁二

4、酸鈉4 g/L、MgSO40.75 g/L、K2HPO43 g/L,、谷氨酸鈉3 g/L;最適培養(yǎng)條件為:溫度30℃,初始pH7.0,搖床轉(zhuǎn)速250 r/min,菌齡36 h。與原始培養(yǎng)條件相比,優(yōu)化培養(yǎng)條件下乳酸菌菌體量增長(zhǎng)了25.15％,GABA產(chǎn)率達(dá)到了88.3％,是原始條件下的GABA產(chǎn)率的1.35倍。
　　 第三,對(duì)影響GABA轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了研究,確定最適轉(zhuǎn)化溫度35℃,緩沖液pH4.8,緩沖液濃度0.2 mol/L,

5、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。與原始培養(yǎng)轉(zhuǎn)化條件相比,優(yōu)化培養(yǎng)轉(zhuǎn)化條件下的菌體量有所增加,轉(zhuǎn)化相同時(shí)間時(shí)GABA產(chǎn)率達(dá)到94.73％,是原始條件下的產(chǎn)率的1.42倍。
　　 第四,在5 L發(fā)酵罐上考察了溶氧條件對(duì)LP-GB01-21菌株GABA轉(zhuǎn)化的影響,結(jié)果表明,高溶氧條件有利于菌體生長(zhǎng),低溶氧條件有利于GABA生成。本論文還對(duì)GABA補(bǔ)料轉(zhuǎn)化進(jìn)行初步研究,以70 g/L的投料量投料3次,轉(zhuǎn)化80 h時(shí)GABA濃度達(dá)到143.5

6、5g/L,產(chǎn)率為97.56％。同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體系pH對(duì)GABA轉(zhuǎn)化影響較大,根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)確定緩沖液最適pH為4.8～5.0,因此在前面補(bǔ)料轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上控制轉(zhuǎn)化體系pH為5進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化70 h時(shí)GABA產(chǎn)率即高達(dá)99.13％,說明控制轉(zhuǎn)化體系pH可縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間,提高轉(zhuǎn)化效率。
　　 本實(shí)驗(yàn)選育的菌株LP-GB01-21及其GABA生產(chǎn)工藝已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利,轉(zhuǎn)讓于山東某生產(chǎn)企業(yè),目前已經(jīng)完成噸級(jí)發(fā)酵罐中試,預(yù)期建成我國(guó)微