miR-184對神經(jīng)干細胞增殖分化的影響及其分子機制.pdf

1、研究背景:
　　神經(jīng)干細胞(Neural Stem Cells，NSCs)是一類具有增殖和多向分化能力的細胞。哺乳動物中，NSCs主要存在于側腦室的腦室下區(qū)(SVZ)及海馬的顆粒細胞下層(SGZ)，研究表明NSCs具有再生及修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能，但目前仍不十分清楚NSCs增殖及定向分化機制，因此有必要進一步探究NSCs的增殖分化機制。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長約18～22 nt小單鏈RNA分子，通過m

2、iRNA5'端與其靶分子mRNA3'端的UTR序列特異互補結合后，對mRNA起負調控作用。成熟miR-184在細胞內的主要表達形式為單鏈miR-184-3P，目前對miR-184在神經(jīng)組織細胞中的作用少有研究。
　　本研究通過構建pHBLV-U6-miR-184/miR-184-shRNA-ZsGreen基因過表達及干擾慢病毒載體，并感染體外培養(yǎng)的NSCs，使miR-184在細胞內過表達或沉默，進而探究miR-184對神經(jīng)干細胞增

3、殖分化的影響以及miR-184與Notch信號通路相互作用的分子機制。
　　研究目的:
　　1.構建miR-184基因過表達及干擾慢病毒載體;
　　2.探究miR-184在NSCs中的目標靶基因;
　　3.研究miR-184對NSCs增殖分化的影響及其分子機制;
　　4.研究miR-184與Notch信號通路在NSCs增殖分化時的相互作用機制。
　　研究方法:
　　1.通過RT-PCR技術擴增出

4、miR-184基因和miR-184 shRNA基因，并分別克隆到pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen質粒載體中，構建慢病毒表達載體。分離培養(yǎng)孕14天的胎鼠腦室下區(qū)（SVZ區(qū)）的神經(jīng)干細胞并鑒定。
　　2.實驗細胞分為過表達對照組、miR-184過表達組、干擾對照組和miR-184干擾組，每組分別感染對應的慢病毒，并用終濃度為3μg/mL的嘌呤霉素，進行抗性篩選，收集各組存活細胞繼續(xù)培養(yǎng)至3代。通過RT-qPCR實驗，

5、進行miR-184過表達驗證。
　　3.采用Brdu細胞滲入實驗，檢測各組細胞增殖情況，記錄各組Brdu+/DAPI+的比例。用神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)液培養(yǎng)各組NSCs，細胞免疫熒光法檢測NSCs分化為神經(jīng)元細胞的情況，記錄MAP2+/DAPI+比例。并檢測NeuN蛋白和NeuN mRNA表達水平，以及Notch通路相關蛋白Hes1、Hes5及其mRNA表達水平。
　　4.通過targetScan、iRTarBase、miRan

6、da等軟件預測到Numbl作為miR-184的潛在靶基因，經(jīng)Western blotting法及RT-qPCR法進行NSCs胞內靶基因驗證，并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行驗證。
　　研究結果:
　　1.成功構建pHBLV-U6-miR-184/miR-184-shRNA-ZsGreen慢病毒表達載體。免疫熒光結果顯示分離培養(yǎng)的細胞90％呈Nestin和Sox2雙陽性。
　　2.細胞成功感染慢病毒，抗性篩選培養(yǎng)后，細胞

7、生長良好，RT-qPCR結果顯示，miR-184過表達組的miR-184相對表達量是過表達對照組的67.63±7.53倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.Brdu細胞滲入實驗等實驗結果顯示，與過表達對照組相比較，miR-184過表達組Brdu+/DAPI比例是過表達對照組的1.47±0.05倍，MAP2+/DAPI+比例是過表達對照組的0.88±0.03倍，而與干擾對照組相比較，miR-184干擾組Brdu+/DAP

8、I+比例是干擾對照組的0.84±0.03倍，MAP2+/DAPI+比例是干擾對照組的1.18±0.03倍。與過表達對照組比較，miR-184過表達組的NeuN蛋白及其mRNA相對表達量明顯降低，分別是過表達對照組的0.76±0.02倍、0.75±0.07倍，而與干擾對照組相比較，miR-184干擾組則明顯升高，分別是干擾對照組的1.22±0.01倍、1.54±0.05倍，以上差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與各自對照組比較，miR-

9、184過表達組Hes1、Hes5蛋白及其mRNA相對表達量明顯升高，miR-184干擾組則明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.通過iRTarBase和miRanda等軟件，預測到Numbl是miR-184潛在的靶基因。與過表達對照組相比較，miR-184過表達組的Numbl蛋白的相對表達量明顯降低，是過表達對照組的0.73±0.07倍。與干擾對照組相比較，miR-184干擾組Numbl蛋白相對表達量則升高，是干擾