近江牡蠣多糖的純化、結構鑒定、硒化及其生物活性研究.pdf

1、目的:
　　近江牡蠣是我國南部沿海常見的養(yǎng)殖貝類。其殼為中藥材“牡蠣”的來源之一;其肉品質(zhì)鮮美、富含多種營養(yǎng)成分，且具有多種生物活性;尤其是近江牡蠣多糖具有抗氧化、生精、免疫調(diào)節(jié)等活性。因此如何合理、科學地開發(fā)近江牡蠣資源是一個有意義的課題。當前關于近江牡蠣多糖的研究報道雖然不少，但不夠深入。因此本文擬以中醫(yī)理論為依據(jù)，應用現(xiàn)代技術手段，以近江牡蠣肉為原材料，系統(tǒng)研究近江牡蠣多糖分離、純化工藝及其理化性質(zhì)，并對其進行硒化修飾，得到

2、硒化近江牡蠣多糖。研究近江牡蠣多糖體外抗氧化活性及其作用機制，進而研究其對環(huán)磷酰胺致氧化應激小鼠生精能力的影響，探討近江牡蠣多糖改善環(huán)磷酰胺致氧化應激小鼠生精活力的作用機制。為近江牡蠣多糖相關藥物研究積累資料。為其開發(fā)成藥品及相關功能保健食品奠定理論基礎。
　　方法:
　　1.近江牡蠣多糖提取、分離及純化
　　采用超聲輔助提取近江牡蠣肉中多糖，將近江牡蠣粗多糖用磁性殼聚糖微球(MCM)吸附去除蛋白質(zhì)，再用DEAE-纖維

3、素52及Sephadex G100柱分離純化粗多糖，得到純化多糖組分。
　　2.近江牡蠣多糖理化性質(zhì)及結構鑒定
　　采用苯酚硫酸法測定總糖含量，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，BaCl2-明膠法測定硫酸基含量，烏氏粘度計法測定多糖相對粘度，乙?；磻?GC法測定近江牡蠣多糖的單糖組成，HPLC測定純度及分子量，UV法測定吸收情況，F(xiàn)T-IR法測定官能團及糖環(huán)形式，甲基化、GC-MS測定糖苷鍵連接位點、糖基鏈接次序及分支情況，NM

4、R法測定異頭碳構型、羥基取代情況及糖基鏈接次序，采用剛果紅法測定糖鏈是否具有三股螺旋結構。
　　3.近江牡蠣多糖硒化修飾
　　通過BaCl2-HNO3催化，采用Na2SeO3硒化修飾近江牡蠣多糖，得到其硒化衍生物。
　　4.ORP抑制H2O2誘導TM4細胞氧化應激作用機制研究
　　以小鼠睪丸Sertoli細胞（TM4細胞）為實驗對象，采用H2O2建立TM4細胞氧化應激模型，考察近江牡蠣多糖及其硒化衍生物的抗氧化能

5、力，同時采用實時熒光定量PCR及Western Blot技術檢測TM4細胞中Nrf2基因表達水平和與其相關的上游調(diào)控因子及下游目標蛋白的影響，來研究近江牡蠣多糖及其硒化衍生物的抗氧化活性作用機制。
　　5.ORP抑制環(huán)磷酰胺所致小鼠生殖損傷及其作用機制
　　將Balb/c小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，建立環(huán)磷酰胺介導的雄性小鼠氧化應激模型，考察ORPP及ORPSe對氧化應激小鼠的睪丸組織恢復能力、精子存活率、畸形精子率，采用實時熒光

6、定量PCR及Western Blot技術檢測小鼠睪丸中Nrf2基因表達水平和與其相關的上游調(diào)控因子及下游目標蛋白的影響來研究ORPP及ORPSe拮抗環(huán)磷酰胺導致生殖損傷的作用機制。
　　成果:
　　1.近江牡蠣多糖提取、分離及純化
　　(1)通過超聲輔助提取近江牡蠣臟器中多糖，其得率為9.74±0.55％。近江牡蠣粗多糖中蛋白質(zhì)含量8.62±0.23％。
　　(2)將粗多糖進一步用MCM吸附除蛋白，所合成的MCM

7、材料粒徑為2-6μm，最佳除蛋白吸附溫度50℃，吸附反應時間4h。該方法為物理吸附，吸附過程動力學和吸附等溫線分別可以用拉格朗日準一級動力學方程及Freundlich方程擬合。此外，根據(jù)吸附方程求得△G及△Ea判斷，MCM吸附是自發(fā)、吸熱的物理吸附反應。
　　(3)近江牡蠣粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素52柱按極性洗脫后再經(jīng)Sephadex G100篩分后，得到一個純化組分ORPP，ORPP得率為32.7％。
　　2.近江牡蠣多糖

8、理化性質(zhì)及結構鑒定
　　ORPP中總糖含量為88.7％，硫酸基含量為1.2％，蛋白質(zhì)含量0.17％，糖醛酸含量為8.59％，相對粘度為1.15。其相對分子質(zhì)量為656kDa。ORPP由葡萄糖構成。ORPP具有D-Glc-(1→、→3)-D-Glc-(1→、→4)-D-Glc-(1→及→3，4)-D-Glc-(1→結構，其分支率約為12.7。ORPP無三股螺旋結構。
　　3.近江牡蠣多糖硒化修飾
　　通過BaCl2-HN

9、O3催化，采用Na2SeO3硒化修飾近江牡蠣多糖，得到其硒化衍生物ORPSe中Se元素含量為181.9±5.6μg/g。
　　4.近江牡蠣多糖對TM4細胞中Nrf2/ARE通路的影響
　　ORPP及ORPSe均可以提高H2O2誘導的氧化應激TM4細胞存活率，且細胞存活率與給藥劑量相關。表明ORPP及ORPSe均可以提高TM4細胞抗氧化能力。通過實時熒光定量PCR技術及Western Blot技術分析，ORPP及ORPSe可能

10、通過激活Nrf2/ARE通路，增加Nrf2與Keap1解偶聯(lián)使其進入胞核，激活ARE元件，促進SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶生成，從而提高TM4細胞抗氧化能力。
　　5.近江牡蠣多糖對環(huán)磷酰胺介導的雄性小鼠生殖損傷的作用
　　ORPP及ORPSe可能作為誘導物，提高小鼠睪丸組織中Nrf2表達水平，激活Nrf2/ARE信號通路，有助于下游Ⅱ相解毒酶NQO1及抗氧化酶HO-1等目標基因表達，提高機體對外界抵抗能

11、力，避免因環(huán)磷酰胺導致的氧化應激損傷，緩解雄性小鼠生殖損傷，提高精子數(shù)量、精子存活率，降低畸形精子率。相同劑量下，ORPSe的生精活性顯著優(yōu)于ORPP。
　　結論:
　　本文以近江牡蠣多糖為實驗對象，系統(tǒng)研究其分離、純化工藝，通過物理及化學方法研究其理化性質(zhì)，通過建立H2O2誘導TM4氧化應激模型研究其體外抗氧化活性及其作用機制，建立環(huán)磷酰胺誘導小鼠氧化應激模型考察近江牡蠣多糖體內(nèi)生精活性及其作用機制。發(fā)現(xiàn)MCM材料是一種理

12、想的除粗多糖中蛋白質(zhì)的材料，與酶法、凍融法除蛋白各有優(yōu)勢，適合用于需要同時保留活性蛋白及多肽的粗多糖除蛋白;硒化修飾可以將無機硒嫁接進入多糖中形成有機硒多糖ORPSe，ORPSe是無毒物。ORPP及ORPSe體外抗氧化作用機制應該是通過激活TM4細胞中Nrf2/ARE信號通路，促使SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶生成，從而提高TM4細胞抗氧化能力。此外，ORPP及ORPSe可能通過激活小鼠睪丸Nrf2/ARE信號通路，提