犬下頜骨牽張成骨與胚胎成骨RNA表達譜關(guān)聯(lián)性分析.pdf

1、研究背景：
　　牽張成骨(Distraction osteogenesis，DO)是指在低能量創(chuàng)傷致使的人為骨折情況下，對骨折端之間通過特制的鈦金屬牽張器來施加一個緩慢的牽引力，使逐漸牽張開的間隙中產(chǎn)生新骨的過程，通常被用來為骨發(fā)育不全、骨缺損制造新骨修復(fù)，在臨床上已經(jīng)被證明是極其有效的治療手段。牽張成骨的成骨效率高、效果較穩(wěn)定，每日可在牽張間隙成骨達到1mm，速率達到嬰幼兒生長發(fā)育速度4-6倍，并且暫時未發(fā)現(xiàn)有成骨量的限制。牽張

2、成骨的機制非常復(fù)雜，其成骨的高效率，超越了過去人們所有對骨質(zhì)生成的認識。牽張成骨的分子學(xué)機制，是否和骨折愈合(healing)相似，還是另一種形式的骨再生(regeneration)，亦或是兩者共存的發(fā)展形式，至今仍然未完全清楚。
　　研究目的：
　　牽張成骨的效率極高，達到嬰幼兒生長發(fā)育速度的4至6倍，因此我們提出假想，牽張成骨中牽引機械力或者微創(chuàng)傷等因素，可能激活了機體僅在胚胎發(fā)育期或新生發(fā)育期才活躍的某種因子或信號通路

3、，從而主導(dǎo)了一種與骨修復(fù)甚至骨再生不同的骨生成過程，這可能是一種近似于返祖的生物學(xué)過程。為探明其中的機制，本研究構(gòu)建了犬下頜骨牽張成骨模型及妊娠犬孕胚胎犬模型，利用第二代高通量測序技術(shù)對牽張后即刻取材和固定2周取材的下頜骨牽張區(qū)骨組織、胚胎犬下頜骨組織、骨折犬骨折區(qū)組織、新生犬、2周/4周幼犬和正常成年犬的下頜骨骨組織進行mRNA及miRNA的全基因組表達譜測序。通過對牽張組和其他組下頜骨骨組織的mRNA和miRNA進行全基因組表達差異

4、與關(guān)聯(lián)性分析，更全面地了解牽張成骨與胚胎發(fā)育、骨折愈合成血管成骨的異同點，并探索牽張成骨可能的啟動因素、新骨形成的獨特性、血管發(fā)生等相關(guān)聯(lián)的mRNA和miRNA表達情況及其參與信號通路的情況，篩選出具有關(guān)鍵作用的基因，為后續(xù)的驗證研究提供關(guān)鍵基因表達譜。
　　研究方法：
　　1、廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供實驗中華田園犬共33只。分成11組:(1)牽張后即刻取材組(DO-1)，3只;(2)牽張后固定2周組（DO-2），3只;

5、(3)新生犬組(P-0)，3只;(4)2周幼犬組（P-2），3只;(5)4周幼犬組(P-4)，3只;(6)孕期30天胚胎組(E-1)，3只;(7)孕期35天胚胎組（E-2），3只;(8)孕期50天胚胎組(E-2)，3只;(9)正常對照組(AC)，3只;(10)骨折1組(BF-1)，3只;(11)骨折2組(BF-2)，3只。牽張各組處置:牽張即刻取材組和牽張固定2周組的實驗動物均接受單側(cè)下頜骨單線牽張成骨術(shù)，并于牽張結(jié)束即刻和牽張結(jié)束固定

6、2周后處死，取材牽張區(qū)骨組織，通過標(biāo)本大體觀察、處死前CBCT影像學(xué)觀察和HE染色組織學(xué)觀察以確定牽張效果。胚胎組處置:經(jīng)過術(shù)前B超確認孕期，對孕期30天、35天、50天的妊娠犬執(zhí)行剖腹引產(chǎn)手術(shù)，取材各組活體胚胎，對標(biāo)本進行大體觀察和HE染色，剖腹后妊娠犬回籠飼養(yǎng)。骨折組處置:對實驗犬執(zhí)行骨折手術(shù)，通過鈦板保持骨折間隙，骨折兩組對應(yīng)牽張組以作對照，骨折1組指骨折固定14天后取材（對應(yīng)DO-1組5天的間隙期、7天的牽張期）、骨折2組指骨折

7、固定28天后取材（對應(yīng)DO-2組5天的間隙期、7天的牽張期以及2周的固定期）。另取新生半小時內(nèi)幼犬3只，出生2周、4周幼犬各3只，以及非手術(shù)健康成年犬3只，分別納入新生犬組(P-0)、2周幼犬組(P-2)、4周幼犬組（P-4）和正常對照組(AC)，予以處死取單側(cè)下頜骨骨組織為標(biāo)本。以上動物除妊娠犬外均雌雄不限，成年犬年齡1.5-2.0歲，體重12.5kg±2.5kg(平均13.5kg)。
　　2、提取各組骨組織標(biāo)本的總RNA，經(jīng)質(zhì)

8、檢明確其濃度及純度合格后，同時建立mRNA及miRNA測序cDNA文庫，文庫回收純化后，由Illumina公司Hiseq4000測序平臺進行測序。
　　3、通過高通量測序獲得mRNA、miRNA表達譜，將原始數(shù)據(jù)行mRNA、miRNA基因表達量標(biāo)準(zhǔn)化統(tǒng)計后，將11組樣本分成55個兩兩對比組(1-vs-1)及36組的三實驗組間比對(1-vs-1&1)，對各對比組行mRNA、miRNA差異基因篩選，以及差異mRNA的GO富集分析和KE

9、GG富集分析，并在此差異基因庫里二次篩選能夠提示牽張組、胚胎組、骨折組、正常對照組之間生物學(xué)層面異同點的興趣基因，并作差異性與關(guān)聯(lián)性分析。
　　研究結(jié)果：
　　1、牽張即刻組和牽張固定2周組實驗犬均手術(shù)過程順利，術(shù)后無不良反應(yīng)。牽張器固定牢靠，無松脫、斷裂及變形。觀察所有實驗犬尖牙咬合關(guān)系較牽張前呈下頜左偏突頜改變，下頜骨牽張間隙有類骨樣新生物質(zhì)，說明右側(cè)頜骨成功通過牽張延長。胚胎各組通過剖腹引產(chǎn)術(shù)取得活體犬胚胎，手術(shù)過程順

10、利，取得胎體完整，形態(tài)符合各孕期應(yīng)有的發(fā)育形態(tài)，妊娠犬經(jīng)引產(chǎn)后無不良反應(yīng)，持續(xù)生存。骨折各組手術(shù)過程順利，術(shù)后尖牙咬合關(guān)系能顯示下頜左偏突頜改變，術(shù)區(qū)未出現(xiàn)嚴重感染，鈦板及鈦釘無松脫、斷裂及變形，骨折兩端見纖維樣組織增生，無類骨樣物質(zhì)可被辨識。新生犬幼犬組和正常對照犬組取材過程順利，無特殊。
　　2、從11組樣本中均提取出足量的總RNA，并分別成功構(gòu)建了用于mRNA及miRNA測序所需的cDNA文庫。成功完成了犬下頜骨牽張區(qū)及正常

11、下頜骨骨組織的高通量測序。
　　3、本次測序共獲得22523個表達mRNA基因，綜合55個兩兩對比組和36組三組間比較（1-vs-1&1），通過對差異表達mRNA進行分析后，我們發(fā)現(xiàn)了在牽張即刻組和胚胎犬組都共同表達上調(diào)、而正常組相對下調(diào)的mRNA共50個，以CXCL12、MINOS1、OGN、POSTN、PTN、SFRP2、MFAP5、IGFBP5、HSPB6等最具特征性，其中基因MINOS1、MFAP5、HSPB6均在正常成年

12、犬中幾乎無表達。以上基因功能囊括EMT調(diào)控、血管發(fā)生調(diào)控、間充質(zhì)干細胞及成骨細胞動員等。牽張組與骨折組之間具有聯(lián)系的基因有1921個，以ATF4、CD99L2、IGFBP5、RPL15等特征性最強，這些基因在牽張組和骨折組中具有不同的特征性表達趨勢，主要為EMT調(diào)控，且相對于正常組中均顯著表達（上調(diào)或下調(diào)），代表了牽張成骨與骨折愈合的不同特點。
　　4、本次測序還獲得354個表達miRNA，根據(jù)以上對比組，牽張各組與胚胎各組共同高

13、表達、并在正常組相對下調(diào)表達的基因共46個，尤以miR-136、miR-299、miR-369、miR-376a、miR-380、miR-382、miR-410、miR-432、miR-503、miR-20a、miR-23a、miR-126、miR-370、miR-433最具特征性，其中基因cfa-miR-370、cfa-miR-433均在正常成年犬中無表達。以上基因功能表達囊括血管發(fā)生與血管生成調(diào)控;胚胎干細胞、內(nèi)皮祖細胞與間充質(zhì)干細

14、胞動員;血管內(nèi)皮細胞遷移;成骨細胞與破骨細胞分化調(diào)控;成肌調(diào)控等。此外，我們篩選出牽張組與骨折組之間具有聯(lián)系的基因，并對AC組亦同等量級表達的基因進行排除。獲得了候選基因miR-203、miR-204、miR-205、miR-338、miR-9和miR-34a，這些基因在牽張組和骨折組中具有特征性的表達趨勢，并相對于AC組有顯著表達（上調(diào)或下調(diào)），主要為EMT調(diào)控，提示了牽張成骨與骨折愈合之間基因異同性表達的時空特點，揭示牽張成骨與骨折

15、愈合各自的成血管化及成骨化特點。
　　結(jié)論：
　　牽張成骨中，受初期微創(chuàng)傷造成的缺血性環(huán)境影響、炎癥反應(yīng)刺激、機械牽張力刺激或固定期靜態(tài)牽張力刺激所啟動，出現(xiàn)以下生物學(xué)過程:大量基因自胚胎發(fā)育期后二次顯著表達并調(diào)控以血管發(fā)生(vasculogenesis)為主的成血管化，同時牽張成骨的早期機體的血管生成(Angiogenesis)機制受抑制，固定期后期有多個基因參與了對過載發(fā)育的血管網(wǎng)的限控;免疫性單核細胞受誘導(dǎo)向血管內(nèi)皮細

16、胞分化;上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)被顯著抑制，大量的間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為上皮及內(nèi)皮細胞以形成新的血管網(wǎng);熱休克蛋白受啟動，維持細胞骨架穩(wěn)定來強化成血管化及成骨化過程;多個基因調(diào)控的大量骨髓間充質(zhì)干細胞快速增殖向成骨細胞分化、既有的成骨細胞募集、牽張區(qū)肌肉組織分泌特異蛋白促進骨代謝，維持著新骨快速生成。相較之下，骨折愈合過程中表達基因與牽張成骨差異較明顯，部分基因啟動較牽張成骨緩慢，EMT進程相較于牽張成骨顯著活躍，愈合過程缺乏快速成血管