存活素促大鼠主動脈內(nèi)皮細胞血管生成的實驗研究.pdf

1、周圍動脈疾?。≒eriphery Artery Disease，PAD）是一組表現(xiàn)為外周動脈狹窄、閉塞的疾病，以下肢發(fā)病最為常見。目前對于PAD的治療方法主要有藥物治療、外科手術(shù)治療等。研究認為以上治療方式在增加行走時間及距離，減少截肢率及降低死亡率等方面的效果并不理想。治療性血管生成是治療PAD一種手段，是以血管生長因子的基因、蛋白或內(nèi)皮祖細胞等進行局部或系統(tǒng)干預(yù)以促進缺血組織血管生成，從而改善外周循環(huán)的方法。血管生成是指從已存在的微

2、血管床上芽生出新的，以毛細血管為主的血管系統(tǒng)的過程，主要包括：細胞外基質(zhì)的降解；血管內(nèi)皮細胞的激活、增殖、遷移；管腔結(jié)構(gòu)的形成及血管網(wǎng)的重塑。存活素（Survivin，SVV）基因是一種廣泛表達于胚胎和腫瘤組織的多效性基因，SVV通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡、周期轉(zhuǎn)換、侵襲性等信號通路促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及血管生成。目前SVV基因促進腫瘤血管生成的研究已較深入，但關(guān)于SVV基因促進正常組織或細胞血管生成的研究甚少，實驗采用腺病毒（Adenov

3、irus, Ad）攜帶SVV基因轉(zhuǎn)染大鼠主動脈內(nèi)皮細胞（Rat Aortic Endothelial Cell, RAECs）的方式，觀察SVV基因?qū)AECs增殖、遷移、抗凋亡及血管生成的影響，以期于將SVV基因做為新的PAD治療的血管生成因子。
　　第一部分腺病毒介導(dǎo)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞存活素基因的轉(zhuǎn)染及鑒定
　　目的：鑒定腺病毒介導(dǎo)SVV基因轉(zhuǎn)染RAECs后細胞內(nèi)SVV基因及蛋白的表達情況。
　　方法：根據(jù)對RAE

4、Cs不同的處理將其分為3組：SVV轉(zhuǎn)染組（Ad-GFP/SVV）：RAECs轉(zhuǎn)染攜帶有SVV基因及GFP的腺病毒；陰性對照組（Ad-GFP）：RAECs轉(zhuǎn)染僅攜帶有GFP的腺病毒；空白對照組（RAEC）：RAECs正常培養(yǎng)不做任何處理。用Ad-GFP/SVV組行最佳MOI的鑒定，分別用MOI等于0、10、20、50、100的攜帶有GFP及SVV基因的腺病毒與RAECs共培養(yǎng)，于12h、24h、48h、72h采用流式細胞儀計算感染率，確定

5、最佳MOI和最佳感染時間后用qRT-PCR及Western blot檢測各組RAECs內(nèi)SVV的mRNA及蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染48h后MOI=50的感染率為(95.67±2.16)％，MOI=100的轉(zhuǎn)染率為(94.53±1.76)%，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；qRT-PCR結(jié)果顯示SVV轉(zhuǎn)染組mRNA相對表達量顯著上調(diào)，Western blot結(jié)果顯示與qRT-PCR結(jié)果一致，SVV轉(zhuǎn)染組與空白對照組及陰

6、性對照組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：以MOI=50時攜帶SVV基因的腺病毒轉(zhuǎn)染RAECs48h可顯著提高其SVV基因和蛋白的表達。
　　第二部分存活素基因?qū)Υ笫笾鲃用}內(nèi)皮細胞增殖的影響
　　目的：研究SVV基因?qū)AECs增殖的影響。
　　方法：根據(jù)對RAECs不同的處理將其分為3組：SVV轉(zhuǎn)染組（Ad-GFP/SVV）：RAECs轉(zhuǎn)染攜帶有SVV基因及GFP的腺病毒；陰性對照組（Ad-GF

7、P）：RAECs轉(zhuǎn)染僅攜帶有GFP的腺病毒；空白對照組（RAEC）：RAECs正常培養(yǎng)不做任何處理。按已確定的感染復(fù)數(shù)和感染時間用各組腺病毒轉(zhuǎn)染RAECs，細胞免疫熒光法檢測PCNA表達， MTT法檢測RAECs的增殖活性，Western blot法檢細胞周期蛋白的表達。
　　結(jié)果：SVV轉(zhuǎn)染組的PCNA陽性相對表達量為（85.35±4.93）%；陰性對照組為（51.04±6.86）%；空白對照組為（52.57±5.24）%。MT

8、T法中轉(zhuǎn)染后第1天SVV轉(zhuǎn)染組的OD值為0.93±0.06；陰性對照組為0.77±0.09；空白對照組為0.71±0.14；轉(zhuǎn)染后第2天SVV轉(zhuǎn)染組的OD值為1.28±0.12；陰性對照組為0.91±0.05；空白對照組為0.87±0.06。SVV轉(zhuǎn)染組的PCNA表達量及MTT的OD值顯著高于陰性對照組及空白對照組，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SVV轉(zhuǎn)染組的周期蛋白cyclin B1、cyclin D1、 cyclin E、

9、 CDC2、 CDK4、CDK2表達明顯上調(diào)，與空白對照組及陰性對照組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：SVV基因通過上調(diào)RAECs周期蛋白的表達促進RAECs的增殖。
　　第三部分存活素基因?qū)Υ笫笾鲃用}內(nèi)皮細胞凋亡的影響
　　目的：研究SVV基因?qū)AECs凋亡的影響。
　　方法：根據(jù)對RAECs不同的處理將其分為4組：SVV轉(zhuǎn)染組（Ad-GFP/SVV）：RAECs轉(zhuǎn)染攜帶有SVV基因及GFP

10、的腺病毒后缺氧條件下培養(yǎng)12h；陰性對照組（Ad-GFP）：RAECs轉(zhuǎn)染僅攜帶有GFP的腺病毒缺氧條件下培養(yǎng)12h；缺氧對照組（Control）：RAECs不行轉(zhuǎn)染缺氧條件下培養(yǎng)12h；空白對照組（RAEC）：RAECs不行轉(zhuǎn)染常氧下培養(yǎng)12h。細胞轉(zhuǎn)染后于缺氧條件下誘導(dǎo)細胞凋亡，采用鬼筆環(huán)肽熒光染色法標記微絲(F-actin)的表達情況，TUNEL綠色FITC標記熒光檢測法及流式細胞儀檢測細胞凋亡的數(shù)量，Western blot檢R

11、AECs內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3，8，9的表達。
　　結(jié)果：各組細胞經(jīng)低氧誘導(dǎo)凋亡后，光鏡下SVV轉(zhuǎn)染組與RAEC組的RAECs形態(tài)良好，細胞間聯(lián)系緊密，熒光顯微鏡下陰性對照組、缺氧對照組出現(xiàn)核固縮、核碎裂等典型的凋亡變化； SVV轉(zhuǎn)染組F-actin平行均勻分布于細胞中，與正常RAECs相似，在陰性對照組和缺氧對照組，F(xiàn)-actin降解增加，呈環(huán)形富集于細胞膜的周邊；流式細胞儀分析結(jié)果示SVV轉(zhuǎn)染組細胞凋

12、亡率顯著降低，與陰性對照組、缺氧對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Western blot結(jié)果示SVV轉(zhuǎn)染組RAECs的 cleaved-Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的表達減少，與陰性對照組、缺氧對照組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：SVV基因通過下調(diào)Caspase-3、8、9的表達抑制低氧誘導(dǎo)的RAECs凋亡。
　　第四部分存活素基因?qū)Υ笫笾鲃用}內(nèi)皮細胞遷移與侵襲的

13、影響
　　目的：研究SVV基因?qū)AECs遷移與侵襲的影響。
　　方法：根據(jù)對RAECs不同的處理將其分為3組：SVV轉(zhuǎn)染組（Ad-GFP/SVV）：RAECs轉(zhuǎn)染攜帶有SVV基因及GFP的腺病毒；陰性對照組（Ad-GFP）：RAECs轉(zhuǎn)染僅攜帶有GFP的腺病毒；空白對照組（RAEC）：RAECs正常培養(yǎng)不做任何處理。細胞轉(zhuǎn)染后采用劃痕實驗， Transwell實驗、基質(zhì)膠小室實驗等評估RAECs的遷移能力，使用Wester

14、n blot檢測細胞內(nèi)MMPs的表達水平。
　　結(jié)果：SVV轉(zhuǎn)染組在6，12，24h遷移距離均較陰性對照組和空白對照組遷移距離顯著增加（P＜0.05）；Transwell實驗中， SVV轉(zhuǎn)染組穿過聚碳酸酯膜的RAECs較陰性對照組和空白對照組顯著增加（P＜0.05）；Western blot結(jié)果示SVV轉(zhuǎn)染組RAECs內(nèi)MMP-2、7、8、9的表達水平均高于陰性轉(zhuǎn)染組和空白對照組。
　　結(jié)論：SVV通過上調(diào)MMP-2、7、8

15、、9的表達增加RAECs遷移和侵襲能力。
　　第五部分存活素基因?qū)Υ笫笾鲃用}內(nèi)皮細胞小管形成及血管生成的影響
　　目的：觀察SVV基因?qū)AECs在體外管腔形成及體內(nèi)血管生成的影響。
　　方法：根據(jù)對RAECs不同的處理將其分為3組：SVV轉(zhuǎn)染組（Ad-GFP/SVV）：RAECs轉(zhuǎn)染攜帶有SVV基因及GFP的腺病毒；陰性對照組（Ad-GFP）：RAECs轉(zhuǎn)染僅攜帶有GFP的腺病毒；空白對照組（RAEC）：RAECs正

16、常培養(yǎng)不做任何處理。SVV基因轉(zhuǎn)染后，將RAECs接種在Martigel基質(zhì)膠預(yù)處理的48孔板中，觀察管腔形成的情況，并用ELISA檢測細胞培養(yǎng)基上清液中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達；將轉(zhuǎn)染后的細胞與Martigel基質(zhì)膠混合液接種至裸鼠皮下，7天后采用HE染色、Masson染色及CD31免疫組化染色評估裸鼠皮下血管生成的情況。
　　結(jié)果：SVV轉(zhuǎn)染組相對于正常對照組的小管與分支的比例顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。EL