人端粒酶RNA(hTER)的純化與結構解析.pdf

1、端粒酶是一類獨特的核糖核蛋白復合物，主要負責維護染色體末端端粒的完整性，以防止不完全DNA復制所造成的基因信息缺失，同時保護染色體的降解和重組。1985年，著名美國科學家、諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者Elizabeth H. Blackburn和Carol W. Greider首次在四膜蟲（Tetrahymena）體內發(fā)現和鑒定出端粒酶。研究發(fā)現，端粒酶在大部分癌癥中扮演上調因子的角色，同時其結構域的突變與多種早衰疾病相關，因此，在過去的二十

2、年里，端粒酶成為了生物醫(yī)學研究領域的焦點，尤其是人端粒酶。人端粒酶主要由一個逆轉錄酶（hTERT）和一個提供逆轉錄模板的 RNA（hTER）以及一系列輔助蛋白組成。其中，人端粒酶RNA（hTER）的突變所導致的人端粒酶缺陷與幾種人類遺傳疾病相關，如先天性角化不良、再生障礙性貧血、脊髓發(fā)育不良和先天性肺纖維化等，因此，作為人端粒酶全酶的重要組成部分，對hT ER的分子生物學和結構生物學研究可為相關疾病的治療和藥物的研發(fā)奠定基礎。然而，在研

3、究hT ER結構這方面，目前不管是二級結構還是通過結晶實驗獲得三維結構，都因其較為復雜的結構特征而無法完成全長的三維結構解析，僅停留在部分區(qū)域的二級結構和三維結構的研究。
　　人端粒酶RNA（hTER）是一條含有451個核苷酸的轉錄本，本文采用體外轉錄法獲得 hTER，并以 SHAPE化學法（Selective2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extens ion），即通過 NMIA

4、（ N-methylisato ic anhydride）或1M7（1-methyl-7-nitro isatoic anhydride）等小分子修飾hTER后，經過逆轉錄獲取對應的cDNA片段，以此來分析RNA序列的單核苷酸自由度和動態(tài)結構特性，為體外獲悉 hT ER全長的二級結構提供了實驗依據。S HAP E化學法是基于核糖2’-OH位置的親核性，因此比起受堿基對和其他作用力束縛的核苷酸，不受約束的核苷酸能形成更多可以提高2’-OH

5、親核力的構象，從而與具有羥基選擇性的親電體，如NMIA和1M7形成穩(wěn)定的2’羥基加合物。在逆轉錄過程中，逆轉錄反應易在加合物處停止，從而生成不同長度的cDNA，通過檢測不同長度cDNA的熒光值，可找到對應核苷酸的位置和自由度大小，從而判斷該核苷酸在整個RNA結構中的結構特征。
　　本課題獲得了以下成果：1）設計hT ER-S hap e基因和其對應的引物，并優(yōu)化了PCR（polymerase chain reaction）反應體系

6、，得到了高濃度、高純度的DNA作為體外轉錄的基因模板；2）通過體外轉錄獲得了hTER轉錄本，并對RNA進行純化，得到了滿足SHAPE實驗要求的hT ER全長；3）摸索單引物一步法延伸完成較長R NA（大于300 nt）的逆轉錄反應條件，相比運用多個引物，提高了結果的一致性和準確度，其中對于hTER（451 nt），當選用1μM/L hTER初始濃度和49℃延伸溫度時，逆轉錄反應效果最佳，為其他類似高GC含量、序列較長的R NA提供了實驗

7、基礎；4）探索得到1μM/L hT ER經3.9 mM/L NMIA或5 mM/L1M7修飾效果較好；5）采用ShapeFinder軟件處理分析實驗數據，結合已經報道的結果，預測當無 hT ERT蛋白時，hTER的模板區(qū)域一部分掩埋在三維結構中，該區(qū)域核苷酸自由度較低，一部分暴露在外，該區(qū)域核苷酸自由度相對較高；CR4/CR5結構域中P6.1具有相對較高的自由度，可能是hT ERT蛋白結合的關鍵區(qū)域。同時，ScaRNA結構域中的Box