重組熒光假單胞菌鞭毛蛋白及黑松與之結(jié)合膜蛋白的研究.pdf

1、松材線蟲攜帶的熒光假單胞菌GcM5-1A（Pseudomonasfluorescens GcM5-1A）的鞭毛蛋白可以通過誘導(dǎo)黑松細(xì)胞的死亡從而促進(jìn)松材線蟲及熒光假單胞菌自身的繁殖。為研究鞭毛蛋白在松萎蔫病中的作用機(jī)理，本文利用PCR技術(shù)從熒光假單胞菌GcM5-1A的基因組中克隆了鞭毛蛋白編碼基因fliC，將該基因克隆到表達(dá)載體pET-15b的NcoI和XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-15b-fliC，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(

2、DE3)，構(gòu)建工程菌，IPTG誘導(dǎo)工程菌高效表達(dá)C-末端具有多聚組氨酸標(biāo)簽的重組鞭毛蛋白，重組蛋白主要以包涵體的形式存在，包涵體經(jīng)8 mol/L尿素溶解，復(fù)性并經(jīng)Ni2+螯合柱親和層析得到了電泳純的重組鞭毛蛋白。
　　 生測結(jié)果表明，重組鞭毛蛋白可引起黑松細(xì)胞的大量死亡，100μ g/mL重組鞭毛蛋白處理黑松細(xì)胞30 h，死亡率達(dá)到72％以上。經(jīng)重組鞭毛蛋白處理后的黑松愈傷組織懸浮細(xì)胞與天然鞭毛蛋白處理的黑松愈傷組織細(xì)胞有相似的

3、形態(tài)變化，證明通過基因手段重組表達(dá)的鞭毛蛋白與天然的熒光假單胞菌鞭毛蛋白在松萎蔫病致病過程中有相類似的作用機(jī)理。
　　 利用重組的鞭毛蛋白作為配體，通過與提取的黑松細(xì)胞膜上的全蛋白特異結(jié)合來尋找鞭毛蛋白的結(jié)合膜蛋白，鞭毛蛋白與結(jié)合蛋白形成的復(fù)合體加熱變性并經(jīng)SDS-PAGE分離后，得到了大小約為50kDa的膜蛋白。將分離到的結(jié)合蛋白進(jìn)行N末端序列測定，該蛋白可能的N端序列:NH2-Glu-Val-Asn-Val-Ala-Thr-