HBx介導的腎小管上皮細胞免疫調節(jié)作用及機制研究.pdf

1、目的:探討乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）對腎小管上皮細胞免疫調節(jié)作用的影響及TLR4在其中的作用。
　　方法:（1）選取6周齡C57BL/6J-TgN轉基因小鼠適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為實驗組、干預組，另取C57BL/6J小鼠作為正常對照組，干預組于小鼠第8周齡尾靜脈注射TLR4 shRNA慢病毒，每4周注射一次。分別于第8、12、16、20、24周齡采集小鼠血液、尿液標本，于第24周齡處死小鼠，觀察小鼠腎功能及腎組織病理變化，并采用

2、免疫組化及免疫熒光觀察腎組織HBx、TLR4表達，巨噬細胞、T細胞浸潤情況及腎小管上皮細胞免疫分子表達情況。（2）構建pcDNA3.1-myc-HBx過表達質粒及TLR4 shRNA質粒，轉染人近端腎小管上皮細胞系（HK-2），Western blot檢測HBx、TLR4的表達，流式細胞術觀察HK-2細胞MHC-II、CD40表達；混合淋巴細胞反應（MLR）檢測共培養(yǎng)后流式細胞術檢測CD4+T細胞CD40L的表達及CD4+T細胞增殖的能

3、力；ELISA測定MLR上清中 IFN-γ、IL-4含量；用上述HK-2細胞的培養(yǎng)上清去刺激巨噬細胞，檢測巨噬細胞粘附性，ELISA及Real-time PCR檢測MCP-1、TNF-α、IL-1β表達。（3）采用Western blot檢測HK-2細胞TLR4下游信號通路MyD88、IRAK4、TRAF6、TRAM、TRIF、IRF3、p-IRF3的表達，激光共聚焦檢測p-IRF3、NF-κB p65的定位，ELISA檢測炎癥因子TN

4、F-α、IL-6表達及IFN-β表達；經MyD88抑制劑干預后，檢測HK-2細胞MHC-II、 CD40表達的變化。
　　結果:（1）和對照組相比，C57BL/6J-TgN轉基因小鼠自16周齡起24 h尿蛋白增加，第24周齡血肌酐顯著增加，腎功能惡化，腎小球腎小管均有不同程度損傷。腎小管上皮細胞可見HBx及TLR4的表達，腎小管間質T細胞及巨噬細胞浸潤明顯，且腎小管上皮細胞MHC-II、CD40表達上調，浸潤的T細胞CD40L表達

5、增加；經TLR4 shRNA干預后，尿蛋白減少，腎功能緩解，腎小管上皮細胞TLR4表達降低，浸潤的T細胞及巨噬細胞減少，且腎小管上皮細胞MHC-II、CD40的表達及浸潤的T細胞CD40L表達都有所降低。（2）轉染HBx基因的HK-2細胞TLR4、MHC II、CD40表達均上調，體外刺激T細胞增殖能力增強，T細胞CD40L表達增加，且T細胞分泌的IFN-γ/IL-4比值增高，體外刺激巨噬細胞活化，粘附性增強，分泌趨化因子MCP-1及炎

6、癥因子TNF-α、IL-1β增加；經TLR4 shRNA干預后，HK-2細胞TLR4、 MHC-II、 CD40表達均下調，且刺激 T細胞增殖能力減弱，T細胞CD40L水平下降，IFN-γ/IL-4比值下降，刺激巨噬細胞活化能力亦減弱，巨噬細胞粘附性降低，分泌趨化因子MCP-1及炎癥因子TNF-α、IL-1β減少。（3）轉染HBx基因的HK-2細胞中TLR4下游MyD88依賴信號通路分子MyD88、IRAK4、TRAF6表達均增加，NF

7、-κB p65入核亦增加，炎癥因子TNF-α、IL-6表達增加；非MyD88依賴信號通路分子TRAM、TRIF、IRF3、p-IRF3的表達亦增加，p-IRF3入核，IFN-β表達增加。使用MyD88抑制劑抑制MyD88信號通路后，HK-2細胞MHC-II、CD40表達均明顯下調。
　　結論:HBx可促進腎小管上皮細胞MHC-II及共刺激分子表達，發(fā)揮抗原提呈細胞樣功能，進一步促進T細胞的激活、分化，并促進巨噬細胞活化，可能由此參