牙髓干細(xì)胞復(fù)合微納結(jié)構(gòu)HA修復(fù)牙槽骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本研究的目的在于探討表面微納結(jié)構(gòu)形貌修飾的輕基磷灰石（micro-nano structured hydroxyapatite，m n H A)生物陶瓷復(fù)合牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs)修復(fù)牙槽骨缺損的效果。首先，分離培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞并探討其干細(xì)胞特性及成骨向分化能力；其次，體外研究mnHA對 DPSCs的生物學(xué)作用；最后，在大鼠牙槽骨缺損動物模型中探討mnHA復(fù)合DPSCs的體內(nèi)

2、成骨效果。
　　材料和方法：
　　1.采用改良組織塊法原代培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞，免疫磁珠法分選Stro-l+人牙髓干細(xì)胞。通過CCK8檢測人DPSCs的增殖活性；免疫熒光染色檢測細(xì)胞表面波形絲蛋白（Vimentin)、細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，C K)、S-100和 Stro-1的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測其干細(xì)胞表面特征性標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD45的表達(dá)。
　　2.體外誘導(dǎo)人DP

3、SCs成脂向分化，油紅染色觀察成脂誘導(dǎo)后脂滴的形成情況。成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)人D P S C s向成骨細(xì)胞分化，通過堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，A L P)染色觀察成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞的成骨活性；茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況；Real-time P C R檢測成骨相關(guān)基因A L P、I型膠原（collagen I，Col I)、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription fac

4、tor2，Runx2)和骨媽素（osteocalcin，O C N) m R N A的表達(dá)。
　　3.體外分離培養(yǎng)大鼠DPSCs后分別接種到mnHA生物陶瓷和表面光滑致密的傳統(tǒng) H A生物陶瓷上。通過細(xì)胞骨架蛋白染色、掃描電鏡（scanning electron microscope，S E M)、M T T、A L P染色和活性檢測以及 Real-time P C R檢測mnHA生物陶瓷對DPSCs的粘附、增殖以及促進(jìn)成骨/成血

5、管相關(guān)因子表達(dá)的作用。
　　4.建立大鼠牙槽骨缺損動物模型并植入材料進(jìn)行修復(fù)。實(shí)驗(yàn)分為五組：（1)傳統(tǒng)表面光滑致密的H A生物陶瓷（HA)；(2)表面微納結(jié)構(gòu)形貌修飾HA生物陶瓷（mnHA)；(3)傳統(tǒng)表面光滑致密的H A生物陶瓷復(fù)合大鼠DPSCs(HA+DPSCs)；(4)表面微納結(jié)構(gòu)形貌修飾H A生物陶瓷復(fù)合大鼠DPSCs(mnHA+DPSCs)；(5)空白對照組（Control)。通過 Micro-CT、四環(huán)素/茜素紅/鈣黃

6、綠素三色序列熒光染色以及組織學(xué)觀察并檢測新骨的形成和礦化情況。
　　結(jié)果：
　　1.通過改良組織塊結(jié)合免疫磁珠法成功分離并純化人DPSCs。人 D P S C s形態(tài)多呈長梭形，具有較強(qiáng)的增殖能力，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD105、CD29和 Stro-1，而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34和 CD45陰性表達(dá)。
　　2.人 DPSCs成脂向誘導(dǎo)后，油紅染色可見脂滴形成。成骨向誘導(dǎo)后，人D P S

7、C s具有較強(qiáng)的成骨向分化潛能。在成骨誘導(dǎo)過程中，人 DPSCs A L P染色呈陽性，同時 ALP m R N A表達(dá)水平升高；成骨相關(guān)基因Col I和 Runx2 mRNA的表達(dá)呈先升高后下降的趨勢；而 OCN mRNA的表達(dá)隨著時間的推移呈不斷升高的趨勢；誘導(dǎo)21天茜素紅染色可見礦化結(jié)節(jié)形成。
　　3.與傳統(tǒng)表面光滑致密的H A生物陶瓷相比，表面微納結(jié)構(gòu)形貌修飾的H A生物陶瓷可明顯促進(jìn)大鼠DPSCs的早期粘附、增殖、成骨向

8、分化以及血管生長因子的表達(dá)，A L P活性明顯增加，成骨相關(guān)基因Runx2、O C N、牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，D S P P)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（dentin matrix protein-1，DMP-1)以及成血管相關(guān)基因血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1) mRNA

9、的表達(dá)增高。
　　4.大鼠牙槽骨缺損修復(fù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，材料修復(fù)組骨體積和組織體積的比值(bone volume relative to tissue volume，B V/T V)、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. T h)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb. N)、序列焚光染色和新骨形成量均高于空白對照組。其中m n H A組 BV/TV、Tb. Th、Tb. N、序列熒光染色和新

10、骨形成較H A組高，而 mnHA生物陶瓷復(fù)合DPSCs后可進(jìn)一步增強(qiáng)其在體內(nèi)的成骨效果。
　　結(jié)論：
　　1.通過改良組織塊聯(lián)合免疫磁珠分選法可成功培養(yǎng)并獲得純度較高的人DPSCs,所獲得的細(xì)胞具備了間充質(zhì)來源干細(xì)胞的生物學(xué)表型和特性，具有較強(qiáng)的成骨向分化潛能，在成骨、成脂誘導(dǎo)液作用下可分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。
　　2.與傳統(tǒng)表面致密光滑的H A生物陶瓷相比較，表面微納結(jié)構(gòu)形貌修飾的HA生物陶瓷具有促進(jìn)DPSCs早期