TGF-β1在乳腺癌微環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞形成的機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤微環(huán)境已經(jīng)成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。對(duì)于許多實(shí)體瘤而言，尤其是癌組織，他們的微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞本身、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成，通過(guò)分泌細(xì)胞因子或者細(xì)胞之間互相作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。尤其是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs），是腫瘤微環(huán)境中激活的成纖維細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。TGF-β1作為一個(gè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，在腫瘤微環(huán)境起著重要的作用，既可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，也可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但是，TGF-β1在腫瘤微環(huán)境中的作用機(jī)

2、制尚不明確。而且，我們的臨床結(jié)果顯示在乳腺癌病人的腫瘤組織中TGF-β1的表達(dá)與CAFs的表型標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明TGF-β1的表達(dá)與CAFs的形成有關(guān)，但是其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。
　　首先，本課題將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3血清饑餓24 h，建立體外營(yíng)養(yǎng)剝奪模型，也是為了模擬腫瘤微環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)剝奪的條件。并考察TGF-β1在一定濃度下（2.5 ng/ml）對(duì)血清饑餓的NIH3T3細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T

3、GF-β1不僅緩解了饑餓導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡，而且TGF-β1能夠誘導(dǎo)饑餓的成纖維細(xì)胞 NIH3T3的CAFs表型的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，TGF-β1能夠增強(qiáng)經(jīng)饑餓處理NIH3T3細(xì)胞的MDC陽(yáng)性率、自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，而自噬抑制劑3-MA卻阻斷了TGF-β1的作用，降低了自噬的發(fā)生。共聚焦和電鏡的結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TGF-β1增強(qiáng)經(jīng)饑餓處理的NIH3T3細(xì)胞自噬的發(fā)生。
　　其次，自噬是應(yīng)激條件下修復(fù)細(xì)胞損傷的

4、主要機(jī)制之一，并且自噬與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也密切相關(guān)。因此，本課題以TGF-β1增強(qiáng)血清饑餓狀態(tài)下NIH3T3細(xì)胞自噬功能的角度研究和探討了TGF-β1緩解血清饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞 CAFs的表型形成的作用機(jī)理。為此，我們依次進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：（1）采用自噬促進(jìn)劑(Rapa)和自噬抑制劑（3-MA）探討了自噬是否參與了TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用和CAFs的轉(zhuǎn)變作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示自噬促進(jìn)劑進(jìn)一步增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)

5、胞增殖和線粒體功能，而自噬抑制劑則抑制了TGF-β1的作用，阻斷了TGF-β1的抗凋亡作用和CAFs轉(zhuǎn)變作用。（2）采用siRNA技術(shù)干擾Atg5后檢測(cè)自噬水平、細(xì)胞凋亡和壞死情況以及CAFs表型蛋白α-SMA和FAP-α的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Atg5 siRNA不僅阻斷了TGF-β1誘導(dǎo)的自噬的發(fā)生，而且廢除了TGF-β1對(duì)經(jīng)饑餓處理NIH3T3細(xì)胞的作用，提示自噬是TGF-β1緩解血清饑餓狀態(tài)下NIH3T3細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)CAFs表型形

6、成的作用靶點(diǎn)。（3）我們采用TGF-βR1/ALK5抑制劑LY-2157299探討了TGF-β1介導(dǎo)的自噬緩解血清饑餓狀態(tài)下NIH3T3細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)CAFs表型形成的具體分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LY-2157299能夠阻斷TGF-β1的經(jīng)典通路-Smad通路，而且進(jìn)一步阻斷了TGF-β1誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和 CAFs表型標(biāo)志蛋白的表達(dá)。綜合以上所有結(jié)果，我們推斷出TGF-β可以通過(guò)激活Smad通路提高線粒體自噬的水平，在營(yíng)養(yǎng)剝奪狀

7、態(tài)下清除受損的線粒體和降低細(xì)胞凋亡水平，從而一定程度上修復(fù)細(xì)胞損傷；并且 TGF-β可通過(guò) Smad/自噬通路在營(yíng)養(yǎng)剝奪狀態(tài)下誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞CAFs表型的形成。
　　最后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證TGF-β1介導(dǎo)的自噬在營(yíng)養(yǎng)剝奪狀態(tài)下能夠修復(fù)成纖維細(xì)胞的損傷和誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中CAFs表型的形成，我們采用小鼠混合移植瘤模型，即小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1和小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3以1：2的比例混合接入Balb/c小鼠內(nèi)，從體內(nèi)去探討TGF-β1誘導(dǎo)

8、的自噬對(duì)腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞的作用以及其對(duì)腫瘤發(fā)展進(jìn)程實(shí)驗(yàn)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，血清饑餓顯著提高了腫瘤組織的自噬水平，但是卻抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，增加了腫瘤組織的凋亡和壞死水平。而TGF-β1能夠顯著增強(qiáng)腫瘤組織的自噬水平和誘導(dǎo)CAFs表型的形成，并且促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，也緩解了腫瘤組織的凋亡和壞死情況。而自噬抑制劑3-MA則抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的自噬，廢除了TGF-β1誘導(dǎo)的CAFs轉(zhuǎn)變作用，從而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。