Paralemmin-3在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：構(gòu)建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)重組腺病毒載體，以所構(gòu)建的重組腺病毒載體感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和大鼠，在體內(nèi)和體外實驗中探討PALM3在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用；同時利用免疫共沉淀檢測 LPS刺激后 PALM3是否與 TLR4信號通路中的接頭分子 MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6存在相互作用，以探討下調(diào)PALM3表達(dá)對急性肺損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。

2、
　　研究方法：
　　1.靶向大鼠PALM3基因的shRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　按RNAi設(shè)計原則，分別設(shè)計3條針對大鼠PALM3基因的shRNA，插入穿梭質(zhì)粒pGV120-EGFP，并行PCR、測序鑒定，采用AdMAXTM包裝系統(tǒng)將穿梭質(zhì)粒pGV120-EGFP和骨架質(zhì)粒pBHGlox-E1，3Cre共轉(zhuǎn)入包裝293細(xì)胞中，包裝出靶向大鼠 PALM3基因 shRNA重組腺病毒載體 Ad.PALM3-shR

3、NA-1， Ad.PALM3-shRNA-2，Ad.PALM3-shRNA-3，擴(kuò)增并純化重組腺病毒后采用TCID50法測定病毒滴度。通過酶消化法分離大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AECⅡ)，經(jīng)差速離心和免疫黏附法純化AECⅡ，進(jìn)行原代培養(yǎng)并采用肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(SP-C)對 AECⅡ鑒定。針對不同 PALM3靶序列的重組腺病毒(Ad.PALM3-shRNA-1， Ad.PALM3-shRNA-2，Ad.PALM3-shRNA-3)分別

4、轉(zhuǎn)染 AECⅡ細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并確定感染復(fù)數(shù)(MOI)值，Western Blot檢測AECⅡ中PALM3蛋白的表達(dá)水平，評價三組重組腺病毒的干擾效率，選擇干擾效率最佳的重組腺病毒用于后續(xù)實驗。
　　2.干擾PALM3表達(dá)對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的保護(hù)作用
　　依據(jù)第1部分實驗結(jié)果，選擇干擾效率最佳的Ad-PALM3-shRNA-1用于后續(xù)實驗。用經(jīng)鼻滴注的方法，以3×108PFU/只的劑量的建立大鼠重組腺病毒

5、Ad.PALM3-shRNA感染模型組（ Ad.PALM3-shRNA組），同時用空病毒載體Ad-EGFP（Ad.EGFP組）和PBS（Control組）作為對照。感染48h后，以LPS(10mg/kg)腹腔注射復(fù)制內(nèi)毒素性急性肺損傷模型。在LPS刺激后的0h、3h、6h、12h、24h和48h各時間點分別用RT-PCR和Western Blot檢測PALM3 mRNA和蛋白表達(dá)情況；同時對比各組間的肺組織病理改變以及模型大鼠的7d存活

6、率的變化；用ELISA法分別檢測各組肺泡灌洗液中和血清中的 TNF-α、IL-1β、IL-6及 MPO表達(dá)水平的變化；用ELISA法檢測肺組織勻漿中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性變化。
　　3.干擾PALM3表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠AECⅡ細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　依據(jù)第1部分實驗結(jié)果，選擇干擾效率最佳的Ad-PALM3-shRNA-1用于后續(xù)實驗。以大鼠AECⅡ細(xì)胞為實驗對象，實驗共分為3組：Ad.PALM3-shRNA組(轉(zhuǎn)染重組腺

7、病毒Ad.PALM3-shRNA-1)，Ad.EGFP組(轉(zhuǎn)染空腺病毒載體Ad.EGFP)及Control組(加入等體積PBS)。轉(zhuǎn)染48h后，3組細(xì)胞均給予LPS(10μg/mL)刺激， LPS刺激后0h，3h，6h，12h，24h，48h收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液，分別應(yīng)用Western Blot及PCR檢測三組細(xì)胞中PALM3蛋白和mRNA表達(dá)水平，用ELISA法分別檢測各組細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平

8、及細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性。
　　4.驗證PALM3是否與LPS-TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的接頭分子存在相互作用
　　同前原代培養(yǎng)大鼠 AECⅡ細(xì)胞，實驗分為兩組：1組給予 LPS10μg/mL(LPS組)，另1組加入等體積PBS(PBS組)，刺激24h后，提取細(xì)胞總蛋白，用WesternBlot法驗證兩組AECⅡ細(xì)胞中PALM3、MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6蛋白含量；用免疫共沉淀方法(CO-I

9、P)驗證PALM3是否與LPS-TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的接頭分子MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6存在相互作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了三組靶向大鼠 PALM3基因 shRNA的重組腺病毒載體：Ad.PALM3-shRNA-1、Ad.PALM3-shRNA-2、Ad.PALM3-shRNA-3，感染滴度分別是3×1010pfu/ml、2×1010pfu/ml和3×1010pfu/ml，均符合實

10、驗要求；AECⅡ細(xì)胞原代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，經(jīng) SP-C免疫熒光鑒定成功。重組腺病毒轉(zhuǎn)染AECⅡ后24h可見綠色熒光表達(dá)，48h熒光強度最高，最佳MOI值為200。三組重組腺病毒以相同MOI值轉(zhuǎn)染AECⅡ48h后，與正常細(xì)胞及空白對照組相比，抑制PALM3蛋白表達(dá)被抑制，其中 Ad.PALM3-shRNA-1的干擾效率最佳備選用于后續(xù)實驗。
　　2.正常大鼠肺組織中存在PALM3的表達(dá)，LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型中肺組織

11、內(nèi)PALM3的表達(dá)增加。與Control組及Ad.EGFP組相比，Ad.PALM3-shRNA組LPS腹腔注射后各時間點大鼠肺內(nèi)PALM3的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與Control組及Ad.EGFP組相比，Ad.PALM3-shRNA組大鼠肺組織的病變減輕、血清中及肺泡灌洗液中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO表達(dá)水平下降、肺組織中NF-κB活性降低、肺損傷大鼠7d存活率顯著提高(P<0.05)。
　　3.給予內(nèi)毒

12、素刺激后，隨著作用時間的延長，大鼠AECⅡ中的PALM3的表達(dá)增加，重組腺病毒Ad.PALM3-shRNA轉(zhuǎn)染后成功下調(diào)AECII中PALM3的表達(dá)（P<0.05）；給予LPS刺激后，與Ad.EGFP組和Control組相比，Ad.PALM3-shRNA組細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量減少，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性受抑（P<0.05）。
　　4.在AECII細(xì)胞中給予LPS刺激與否，均存在PALM3、MyD8

13、8、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6五種蛋白的表達(dá)；CO-IP結(jié)果證實PALM3與IRAK-1存在天然相互結(jié)合，并不依賴于LPS刺激，而給予LPS刺激后，在大鼠ACEⅡ中PALM3能以配體依賴的方式與TIACM-2、TRAF-6相互結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1.干擾 PALM3表達(dá)能減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對內(nèi)毒素性大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用；
　　2. PALM3可能是參與LPS-TLR