家蠶TRAPα基因的表達(dá)與功能分析.pdf

1、哺乳動物TRAPα是一個糖基化蛋白,大小為34 kD,它受到Ca2+的調(diào)控,分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜。在人類骨髓細(xì)胞系中,TRAPα的mRNA轉(zhuǎn)錄受到巨噬性粒細(xì)胞集落刺激因子的正調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),在出生后的小鼠骨骼肌和心臟細(xì)胞中TRAPα表達(dá)有些略微不同,在體內(nèi)系統(tǒng)中首次確定TRAPα蛋白可能在肌肉中和在小鼠心臟內(nèi)皮襯底細(xì)胞的成熟過程中起了特定作用。
　　 從家蠶蛹的cDNA文庫中篩選得到一條含有TRAPα保守結(jié)構(gòu)域的cDNA,并

2、將其命名為BmTRAPα(Bornbyx translocon associated protein alpha),GenBank登陸號為DQ311413。該基因序列長為1389 bp,ORF是840 bp,編碼279個氨基酸殘基,預(yù)測分子量為30.8 kD。將擴(kuò)增得到的BmTRAPα基因產(chǎn)物酶切回收后,克隆到融合表達(dá)載體pET-28a相應(yīng)的酶切位點上,得到重組質(zhì)粒pET-28-BmTRAPα,經(jīng)PCR和酶切鑒定證明重組子正確,將該重組

3、子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體并制樣,SDS-PAGE分析表明,在Marker大小35 kD附近有一濃集特異性蛋白條帶,與預(yù)期值相符(融合標(biāo)簽3.56 kD,BmTRAPα是30.8 kD)。融合蛋白以包涵體形式存在,通過處理包涵體和鎳柱親和層析,純化獲得融合蛋白,并用該融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,ELISA檢測效價大于1:12800。用ProteinA凝膠柱純化多克隆抗體。<

4、br>　　 提取家蠶各時期及五齡幼蟲的各組織蛋白,用于Western blot和ELISA半定量測定BmTRAPα在各時期和五齡幼蟲各組織的含量。Western blot結(jié)果表明,BmTRAPα蛋白在家蠶的蛹期表達(dá)量最高;五齡幼蟲的生殖腺、絲腺、馬氏管和脂肪體有表達(dá),表達(dá)量有所不同,絲腺和脂肪體中表達(dá)量較高,而在血淋巴中沒有檢測明顯的信號。ELISA半定量檢測結(jié)果與Western blot的實驗結(jié)果基本相符。利用熒光定量PCR的方法,