輪狀病毒間接免疫熒光檢測方法的研究.pdf

1、目前，國內(nèi)僅有的輪狀病毒疫苗是由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)并于2000年注冊批準(zhǔn)上市。此疫苗采用lgCCID50和ELISA聯(lián)合法（lgCCID50–ELISA）檢測輪狀病毒滴度，但試驗已證明采用該方法測定病毒滴度在時間花費和重復(fù)性方面有其不足。在本試驗中，我們建立了間接免疫熒光法（indirect immunofluoresce assay,IFA）檢測蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的蘭州羔羊輪狀病毒疫苗的滴度，并對采取兩

2、種檢測方法所得出的結(jié)果進(jìn)行比較。
　　本文重點對IFA法測定輪狀病毒中各條件進(jìn)行優(yōu)化，其中包括MA104細(xì)胞最佳接入密度、稀釋輪狀病毒用胰酶的最適濃度和病毒感染MA104細(xì)胞的最佳時間等。結(jié)果表明：IFA法最佳工作條件為，MA104細(xì)胞密度2×104個/孔為最佳，稀釋病毒用胰酶濃度為1μg/ml，輪狀病毒最佳培養(yǎng)時間為18h，80％的丙酮作為固定液且固定時間為10min，兔抗SA11多克隆抗體為一抗的最適稀釋度和作用時間分別為1:

3、800、60min，Alexa-488標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗的最適稀釋度和作用時間分別為1:500、60min。通過以上條件的摸索，確立了輪狀病毒滴度的檢測方法。
　　將已知輪狀病毒滴度的樣品1×106FCFU/ml經(jīng)倍比稀釋至10FCFU/ml，應(yīng)用IFA法檢測各稀釋倍數(shù)的滴度，最后確定應(yīng)用該方法測定病毒樣品的敏感性為10FCFU/ml；采用此IFA法測定經(jīng)RV感染的MA104細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈陽性，而檢測狂犬病毒、流感病毒