人巨細(xì)胞病毒UL142基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及編碼蛋白相互作用蛋白的鑒定.pdf

1、目的:
　　人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是皰疹病毒科β屬病毒，種屬特異性強(qiáng)，人是其感染的唯一宿主。HCMV普遍存在于60-90％人群中，它不僅是免疫抑制患者的嚴(yán)重致病原，也是引起新生兒先天及圍生期感染最常見、危害最大的一種病原體。HCMV感染可引起患兒的肝脾腫大，新生兒病理性黃疸，顱內(nèi)鈣化等多器官多系統(tǒng)的疾病和畸形，危害巨大。也可在AIDS和器官移植等免疫功能缺陷的患者中導(dǎo)致致死性的感染。研究HCMV感染的致病機(jī)制及防治對減少HCMV

2、致病危害有重大意義。HCMV的復(fù)制及感染依賴于宿主細(xì)胞對病毒基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相，轉(zhuǎn)錄形式等復(fù)雜影響，不同時(shí)相的病毒基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮各自不同功能和作用。因此研究病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因調(diào)控元件，對進(jìn)一步研究HCMV基因的相關(guān)生物學(xué)作用，揭示HCMV致病機(jī)理具有重大意義。UL142基因位于HCMV臨床分離株UL/b'區(qū)，在不同分離株中存在多種起始位置不同的基因轉(zhuǎn)錄本，這種轉(zhuǎn)錄起始位置的差異提示UL142基因不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)調(diào)控存

3、在差異，本文采用Northern blot及5'rapid amplification of cDNAends（5'-Full Race）等方法，對UL142基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行精細(xì)研究;同時(shí)采用pGL3雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)(Dual-Luciferase(@)Reporter Assay System)，凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)對UL142基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究;應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)(Yeast two-hybrid sys

4、tems)，篩選與UL142基因編碼蛋白(pUL142)相互作用的文庫蛋白，針對其中的Snapin(SNAP相關(guān)蛋白)，通過體外轉(zhuǎn)錄MagneGSTTM Pull-down技術(shù)，進(jìn)一步確定pUL142與之相互作用，并應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)共定位。UL142作為重要的免疫調(diào)節(jié)基因，可抑制NK細(xì)胞激活，從而對抗NK細(xì)胞的清除作用，因此是研究病毒蛋白如何逃避宿主免疫作用一個(gè)重要切入點(diǎn)，為揭示HCMV的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

5、
　　方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　采用中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保留的HCMV低傳代臨床分離株Han，人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)和人腎上皮細(xì)胞293細(xì)胞(Human Embryonic Kidney293 cells)購買于中科院的上海的細(xì)胞庫;Northern blot試劑盒購自Roche公司，5'-Full Race Kit購自TakaRa公司，pGL3Luciferase ReporterVector

6、s、Dual-Luciferase(@) Reporter Assay System，TheWizard(@) MagnePlasmid DNA Purification System，MagneGSTTM Pull-down試劑盒均購買于Promega公司;LightShift(@)Chemiluminescent EMSA Kit購自thermo公司;human fetal braincDNA library由中科院武漢病毒所肖庚富

7、教授惠贈;Yeasttwo-hybrid systems購自Clontech公司;引物合成及測序由Invitrogen完成;常用設(shè)備包含Beckman臺式低溫高速離心機(jī)、Bio-rad PCR循環(huán)儀、Bio-rad電穿孔和CO2培養(yǎng)箱等;所用數(shù)據(jù)庫和分析及應(yīng)用軟件包含GeneBank、primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物;應(yīng)用DNAClub、BioEdit、DNAStar; Sequin軟件序列比對與提交;TRANSFAC軟件

8、預(yù)測。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬┤司藜?xì)胞病毒UL142基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究
　　1、Northern blot
　　人工合成UL142基因Digoxin(DIG)標(biāo)記特異性RNA探針，應(yīng)用Northern blot方法檢測UL142基因轉(zhuǎn)錄本在不同感染時(shí)期的轉(zhuǎn)錄本的種類、長度及豐度。
　　2、5'RACE
　　通過5'RACE確定UL142轉(zhuǎn)錄本的5'末端。
　　3、熒光素酶報(bào)告基因檢測

9、實(shí)驗(yàn)
　　(1)構(gòu)建pGL3 Basic-UL142基因的上游非編碼區(qū)重組質(zhì)粒，研究UL142基因的上游非編碼區(qū)1000bp是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性;
　　(2)應(yīng)用5'末端系列缺失突變方法，依次遞減300bp縮小調(diào)控區(qū)域范圍，確定含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性片段;
　　(3)構(gòu)建pGL3 Promoter-調(diào)控元件重組質(zhì)粒，進(jìn)行熒光素酶檢測，確定正負(fù)調(diào)控元件。
　　4、凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mob

10、ility shift assay，EMSA)
　　(1)應(yīng)用TRANSFAC軟件預(yù)測與HELF核蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄因子;
　　(2)合成含有標(biāo)記生物素和未標(biāo)記生物素的調(diào)控元件，heat shocktranscription factor1(HSF1)成品蛋白購自于Abcam公司，提取HCMV感染的HELF細(xì)胞的核蛋白;
　　(3)依據(jù)EMSA Kit說明操作，確定HSF1與正調(diào)控元件的特異性結(jié)合能力。
　　（二

11、）人巨細(xì)胞病毒UL142編碼蛋白相互作用蛋白篩選及功能研究
　　1、酵母雙雜交篩選
　　(1)以pACT2(含轉(zhuǎn)錄激活域，activition domain，AD)為酵母表達(dá)載體的人胎腦cDNA文庫增殖，提取文庫質(zhì)粒;
　　(2)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄結(jié)合域(DNA binding domain，BD)重組質(zhì)粒pGBKT7-UL142;
　　(3)將pGBKT7-UL142重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，并將提取的文庫質(zhì)粒

12、轉(zhuǎn)化到含有UL142基因的AH109酵母細(xì)胞中，通過二缺（-Leu-Trp SD）和四缺培養(yǎng)基（-Ade-His-Leu-Trp SD）篩選相互作用的克隆。在二缺培養(yǎng)基上觀察轉(zhuǎn)化效率，四缺培養(yǎng)基進(jìn)行顯色反應(yīng)。初步確定與UL142基因編碼蛋白(pUL142)與人胎腦文庫相互作用蛋白的陽性克隆;
　　(4)提取陽性克隆的酵母質(zhì)粒，用電穿孔轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，在氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中篩選出與pUL142相互作用的文

13、庫質(zhì)粒。將相互作用的文庫質(zhì)?；剞D(zhuǎn)到含有UL142基因的AH109酵母細(xì)胞中，在四缺固體培養(yǎng)基中確定相互作用的文庫蛋白;
　　(5) PCR鑒定后挑取陽性克隆進(jìn)行測序，經(jīng)Genbank生物信息學(xué)軟件進(jìn)行BLAST分析。最終篩選出的文庫質(zhì)粒為pACT2-Snapin。
　　2、GST Pull-down技術(shù)
　　(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Snapin;
　　(2)在大腸桿菌BL21中表達(dá)GST-Snapin，并將其

14、固相化到MagneGSTTMParticles上。利用TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，表達(dá)pGBKT7-UL142融合蛋白;
　　(3)將pGBKT7-UL142與所篩選出的文庫蛋白GST-Snapin共同孵育，通過洗脫結(jié)合得到相互作用的蛋白復(fù)合物，并應(yīng)用進(jìn)行Western blot技術(shù)鑒定。
　　3、激光共聚焦技術(shù)的細(xì)胞定位分析
　　(1、構(gòu)建帶有熒光表達(dá)重組質(zhì)粒pUL142-GFP和pDsRed-Snapin;
　　

15、(2)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pUL142-GFP和pDsRed-Snapin共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中;
　　(3)應(yīng)用共聚焦顯微鏡技術(shù)分別在488nm和543nm波長的激發(fā)光下，觀察互作蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位。
　　結(jié)果:
　　一、人巨細(xì)胞病毒UL142基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究
　　1、通過Northern blot檢測，在Han株的感染晚期(Late，L) RNA中共檢測到三種UL142基因轉(zhuǎn)錄本。
　　2、5，R

16、ACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UL142基因轉(zhuǎn)錄本具有不同的5'末端。5'末端分別位于第9425，9904和9974位核苷酸(GenBank no.GQ981646)。
　　3、通過熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)檢測實(shí)驗(yàn)，確定了UL142基因轉(zhuǎn)錄本上游一個(gè)33bp的正調(diào)控元件。應(yīng)用TRANSFAC軟件預(yù)測與正調(diào)控元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子HSF1。
　　4、EMSA結(jié)果表明，HELF核蛋白中含有與正調(diào)控序列的結(jié)合蛋白HSF1，此種結(jié)合可以被同源序列

17、競爭，通過super-shift及HSF1成品蛋白對照，說明結(jié)合蛋白與調(diào)控序列的結(jié)合為特異性結(jié)合。
　　二、人巨細(xì)胞病毒UL142編碼蛋白相互作用蛋白篩選及功能研究
　　1、通過酵母雙雜交技術(shù)，篩選出與pUL142相互作用的人胎cDNA文庫蛋白共17種，其中篩選的陽性克隆與Snapin高度同源，同源性99％。
　　2、通過GST Pull-down技術(shù)，在體外驗(yàn)證pUL142與Snapin直接相互作用。
　　3、

18、利用激光共聚焦顯微鏡觀察到pUL142-GFP與pDsRed-Snapin共定位于293細(xì)胞質(zhì)中。
　　結(jié)論:
　　1、HCMV UL142基因?yàn)長期基因;共有三種轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，具有不同的5'末端;HCMV UL142基因上游非編碼區(qū)存在一個(gè)正調(diào)控元件，可與轉(zhuǎn)錄因子HSF1特異性結(jié)合;
　　2、篩選17種與HCMV UL142編碼蛋白相互作用的文庫蛋白，其中Snapin與HCMV UL142編碼蛋白具有直接相互作用，并共