大腸桿菌植酸酶的定點(diǎn)突變及其熱穩(wěn)定性.pdf

1、植酸酶是酸性磷酸化酶的一種，可將有機(jī)磷水解為肌醇和無機(jī)磷。植酸酶作為添加劑，應(yīng)用于養(yǎng)殖、食品加工和醫(yī)藥生產(chǎn)中。尤其廣泛的用于添加到動物飼料中，提高飼料中磷的利用率，提高動物的生產(chǎn)性能，減輕動物高磷糞便所導(dǎo)致的環(huán)境的磷污染。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是80年代開發(fā)的一種外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有操作難度低，易于培養(yǎng)，生長速度快，表達(dá)量高，成本低等方面的優(yōu)點(diǎn)，在外源蛋白的表達(dá)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，被廣泛用于醫(yī)藥生產(chǎn)和

2、科學(xué)研究。本研究以來源于大腸桿菌的植酸酶基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料，采用定點(diǎn)突變的方法，通過對密碼子優(yōu)化后的植酸酶基因appAm進(jìn)一步突變，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，通過比較各菌株產(chǎn)植酸酶的性質(zhì)，篩選熱穩(wěn)定性好的植酸酶基因工程菌。主要內(nèi)容包括：
　　⑴運(yùn)用生物化學(xué)和分子生物學(xué)的相關(guān)知識，確定了6個(gè)突變位點(diǎn)并設(shè)計(jì)了6對分別含有6個(gè)突變位點(diǎn)的互補(bǔ)引物。將連接在pGEM-T-easy載體上的appAm基因進(jìn)行單突變和疊加突變。以pPIC9為穿梭載體，通過LiC

3、1轉(zhuǎn)化方法，將各個(gè)突變體基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115菌株中。通過SDS-PAGE和酶活檢測的方法，篩選出分別含有不同突變位點(diǎn)的6個(gè)陽性重組菌株(M1，K24E，K43E，C2，M2，M4)。
　?、茖ν蛔兦暗腁PPA及其6個(gè)突變體的蛋白純化方法進(jìn)行了優(yōu)化，在經(jīng)過硫酸銨沉淀，離子交換吸附色譜，葡聚糖凝膠色譜三步純化后，粗酶液中的色素和DNA等雜質(zhì)已經(jīng)基本去除，得到純度較高的蛋白，可進(jìn)行下一步的功能分析。
　?、峭ㄟ^鉬藍(lán)法對各個(gè)

4、純化后的植酸酶進(jìn)行酶活測定，確定各個(gè)突變體蛋白的最適溫度和耐熱性、最適pH和pH穩(wěn)定性、Km、Vm等。結(jié)果表明:突變體M2和M4的最適反應(yīng)溫度提高了5℃，為65℃;突變體K24E的最適pH減小了0.5，為4.0;除C2和K43E外，其余幾種突變后植酸酶在pH2～8處理2h后，活性都能保持在80％以上;突變體M2，M4，K24E和M1仍保留50％以上的活性，而突變前的APPA在70℃處理20 min之后，就幾乎沒有殘余活性。
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