不同鎮(zhèn)痛藥對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一章不同鎮(zhèn)痛藥對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響
　　目的：探討不同鎮(zhèn)痛藥（嗎啡、布洛芬、塞來(lái)昔布、氯胺酮）對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響。
　　方法：人肝癌QGY-7703細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別接種于培養(yǎng)板或25cm2培養(yǎng)瓶中。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將兩種細(xì)胞分別隨機(jī)分為13組(n=6)：不同濃度布洛芬組(IB1-3組)布洛芬終濃度分別為250 umol/L、500 umol/L、1000umol/L；塞來(lái)昔布組(CE1-3組):塞來(lái)昔

2、布終濃度分別為25umol/L、50umol/L、100umol/L；嗎啡組(MO1-3組)：?jiǎn)岱冉M終濃度分別為0.01umol/L、10umol/L、1000umol/L；氯胺酮組(KE1-3組):氯胺酮終濃度分別為100umol/L、500umol/L、1000umol/L；以及正常對(duì)照組(C組)：加入等容量的RPM-l640培養(yǎng)基。分別于孵育24、48和72h時(shí)，采用cck-8法測(cè)定各組細(xì)胞增殖抑制率。于孵育48h后，用流式細(xì)胞術(shù)

3、檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率及其周期情況；采用利用Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　結(jié)果：與C組比較，IB1-3組、CE1-3組、MO1-3組和KE1-3組等十二組細(xì)胞的增殖抑制率均依次升高，且依照藥物作用的濃度和時(shí)間的增加而依次升高，具有濃度和時(shí)間的依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與C組比較，IB1-3組、CE1-3組、MO1-3組和KE1-3組等十二組細(xì)胞遷移和侵襲能力均降低，且依照藥物作用的濃度的增加

4、而依次降低，具有濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與C組比較，IB1-3組、CE1-3組、MO1-3組和KE1-3組等十二組細(xì)胞凋亡率均增加，且依照藥物作用的濃度增加而依次增加，具有濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與C組比較，IB1-3組、CE1-3組和MO1-3組等九組細(xì)胞的G1期細(xì)胞百分比均升高，S期和M期細(xì)胞百分比均降低，且依照藥物作用濃度的增加而依次變化，具有濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

5、；KE1-3組細(xì)胞的G1期和S期細(xì)胞百分比均升高，M期細(xì)胞百分比均降低，且依照藥物作用的濃度的增加而依次變化，具有濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論布洛芬、塞來(lái)昔布、嗎啡和氯胺酮均可以抑制人肝癌QGY-7703細(xì)胞的增殖，并可降低肝癌QGY-7703細(xì)胞的侵襲和遷移的能力，可能與其促進(jìn)細(xì)胞的凋亡并使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯有關(guān)。
　　第二章布洛芬抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究
　　目的：探討PI3K/Akt/

6、mTOR通路和IKKβ/IκBα/NF-κB通路在布洛芬抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。
　　方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌細(xì)胞QGY-7703，采用隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組（C組）:加入等容量的RPM-l640培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組（IB組）：按照不同布洛芬作用濃度分為三個(gè)亞組：IB1組（布洛芬作用濃度為250umol/L），IB2組（布洛芬作用濃度為500umol/L）、IB3組（布洛芬作用濃度為1000umol/L）。各組分別作用48后，采用Rea

7、l-TimePCR測(cè)各組細(xì)胞中IKKβ、Bcl-2、PI3K、PTEN和MMP-9基因表達(dá)的變化。用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和IKKβ/IκBα/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子
　　與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組三組細(xì)胞PTEN mRNA和PTEN蛋白表達(dá)明顯升高，且隨著布洛芬作用濃度的增加依

8、此升高，具有濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組三組細(xì)胞PI3K mRNA、Akt蛋白和mTOR蛋白的表達(dá)量均無(wú)明顯差異(P＞0.05)；與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組等三組細(xì)胞MMP-9 mRNA和MMP-9蛋白的表達(dá)以及 p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)均顯著下降，且隨著布洛芬作用濃度的增加依此降低，具有良好的濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.

9、IKKβ/IκBα/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)相關(guān)因子表達(dá)的結(jié)果
　　與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組三組細(xì)胞IKKβmRNA和Bcl-2mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，且依照布洛芬作用濃度的增加而依次下調(diào)，具有濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組三組細(xì)胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，且隨著布洛芬作用濃度的增加依此降低，具有良好的濃

10、度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：布洛芬對(duì)QGY-7703細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制可能與其對(duì)細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR和IKKβ/IκBα/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。
　　第三章鎮(zhèn)痛藥物處理后肝癌QGY-7703細(xì)胞差異表達(dá)基因的篩選
　　目的:探究鎮(zhèn)痛藥（塞來(lái)昔布、嗎啡和氯胺酮）抑制肝癌QGY-7703細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制
　　方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組(n=3

11、)：QGY-7703細(xì)胞分為：塞來(lái)昔布組(CE組):塞來(lái)昔布作用濃度為50umol/L；嗎啡組(MO組)：?jiǎn)岱茸饔脻舛葹?0 umol/L；氯胺酮組(KE組):氯胺酮作用濃度為500umol/L；對(duì)照組(C組)加入等容量的RPM-l640培養(yǎng)基。各組培養(yǎng)48h后，采用全基因組表達(dá)譜芯片,篩查鎮(zhèn)痛藥物（塞來(lái)昔布、氯胺酮和嗎啡）處理后QGY-7703細(xì)胞差異表達(dá)基因,并進(jìn)行生物信息學(xué)功能和通路分析。
　　結(jié)果：與C組相比，在CE組細(xì)胞

12、中有141個(gè)基因表達(dá)增加，50個(gè)基因表達(dá)下降；而在KE組中有1032個(gè)基因表達(dá)增加，899個(gè)基因表達(dá)下降；而在MO組中有766個(gè)基因表達(dá)上升，311個(gè)基因表達(dá)下降。其中KE組和CE組兩組共同調(diào)控基因有34個(gè)； KE組和MO組兩組共同調(diào)控基因195個(gè)；MO組和CE組兩組共同調(diào)控18基因個(gè)；KE組、CE組和MO組三組共同調(diào)控基因17個(gè)。
　　生物學(xué)通路分析顯示：與C組相比，CE組差異基因主要涉及應(yīng)急、細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)、生物大分子代謝等方

13、面，參與PPAR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等的改變；KE組差異基因主要涉及細(xì)胞周期、RNA的代謝等方面，參與溶酶體、基因的剪接與復(fù)制相關(guān)通路和P53信號(hào)通路等通路的改變；MO組差異基因主要涉及生物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA的代謝等方面，參與抗原的加工和提呈、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等相關(guān)通路、MAPK信號(hào)通路等通路的改變
　　結(jié)論：本研究成功篩選出鎮(zhèn)痛藥（塞來(lái)昔布、嗎啡和氯胺酮）處理后人肝癌QGY-7703細(xì)胞差異表達(dá)