朱砂根的轉(zhuǎn)錄組測序及與三萜皂苷合成相關(guān)基因的差異分析.pdf

1、朱砂根（Ardisia crenata sim）為紫金?？谱辖鹋僦参铮俏覈鴤鹘y(tǒng)的觀賞藥用植物，無論從觀賞價(jià)值，藥用保健價(jià)值還是生態(tài)用途以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值都極具開發(fā)利用的潛力。
　　藥用植物功能基因組學(xué)的主要內(nèi)容就是闡明藥用植物生物活性成分的次生代謝過程及其調(diào)控的方式，本研究將以目前最新的測序平臺（Illumina公司的HiSeq2500測序平臺）為基礎(chǔ)，利用水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)處理朱砂根盆栽五年生苗，得到次級代謝產(chǎn)物三

2、萜皂苷含量差異較大的朱砂根，之后對其進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，并做功能基因組學(xué)方面的研究。從生物信息學(xué)的角度，以各個(gè)數(shù)據(jù)庫為依托，以各種分析軟件為手段，對朱砂根及其與三萜皂苷合成途徑相關(guān)的基因進(jìn)行更深入微觀的了解，構(gòu)建的文庫信息以及得到的與三萜皂苷合成相關(guān)的差異基因，為后續(xù)從基因調(diào)控和轉(zhuǎn)基因方面使藥用成分三萜皂苷含量穩(wěn)定提高，奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，于朱砂根及其相近屬藥用價(jià)值的深度開發(fā)具有重要的作用。
　　朱砂根轉(zhuǎn)錄組測序的研究，得到以下結(jié)論

3、:
　　1.通過對2個(gè)差異樣品M1和S1（經(jīng)SA和MJ處理后得到的三萜皂苷含量差異較大的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)材料）進(jìn)行測序，共獲得12.06Gb Clean Data。各樣品CleanData均達(dá)到5.69Gb，Q30堿基百分比在88.42％及以上，表明測序質(zhì)量良好。
　　2.用Trinity軟件De novo組裝后共獲得54，601條Unigene，其中長度在1kb以上的Unigene有14，659條。對54，601條Unigene全

4、部與NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共獲得31，585個(gè)Unigene的注釋結(jié)果。
　　3.在基于Unigene庫的基因結(jié)構(gòu)分析時(shí)，經(jīng)過SSR分析共獲得9，190個(gè)SSR標(biāo)記。同時(shí)還進(jìn)行了CDS預(yù)測和SNP分析。
　　4.使用EBSeq軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析以獲得兩個(gè)樣品之間的差異表達(dá)基因集，運(yùn)用公認(rèn)有效的Benjamini-Hochberg方法篩選出了3010個(gè)差異表達(dá)的基

5、因，其中上調(diào)基因1532個(gè)，下調(diào)基因1478個(gè)。結(jié)果運(yùn)用模式聚類對差異表達(dá)的基因進(jìn)行了展示。
　　5.將3010個(gè)差異基因(DEG Unigene)進(jìn)行功能注釋，共得到2581個(gè)有注釋的基因。在各個(gè)數(shù)據(jù)庫中分別為: COG（1068個(gè)），GO（1937個(gè)），KEGG（701個(gè)），KOG（1386個(gè)），Pfam（2038個(gè)），Swiss-Prot（2000個(gè)），nr(2547個(gè))。
　　6.在GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋和富集分析后

6、，得到富集在GO:0006721節(jié)點(diǎn)上與萜類化合物代謝過程（Terpenoid metabolic process）有關(guān)的Unigene基因有256個(gè)，DEG Unigene基因31個(gè)。
　　7.在COG分類數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計(jì)分析得到了與次生代謝產(chǎn)物生物三萜皂苷合成、運(yùn)輸和分解代謝功能相關(guān)的93個(gè)差異表達(dá)基因直接與朱砂根三萜皂苷的含量相關(guān)。
　　8.將差異表達(dá)的3010個(gè)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋共得到741條代謝通路。其中有22

7、條與多酮類化合物和萜類化合物的代謝(Metabolism of terpenoids andpolyketides)相關(guān)，這些通路潛在的影響三萜皂苷的合成，8條屬于萜類化合物生物合成支柱的通路“Terpenoid backbone biosynthesis”，做富集分析時(shí)在差異表達(dá)基因主要富集的96條通路中，萜類化合物生物合成支柱(Terpenoid backbonebiosynthesis)KO:00900的富集因子為0.68，富集因

8、子值較小，為顯著富集，則表明其與三萜皂苷的合成直接相關(guān)。
　　9.將萜類化合物生物合成支柱（Terpenoid backbone biosynthesis）KO:00900通路的代謝過程整理出來，并相對于對照組做了與上調(diào)和下調(diào)基因相關(guān)的酶的標(biāo)記，之后利用EBSeq軟件計(jì)算得出了上調(diào)下調(diào)倍數(shù)。結(jié)果確定了7個(gè)與代謝過程中關(guān)鍵酶:還原酶羥甲基戊二酸-CoA輔酶A、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、二磷

9、酸甲羥戊酸脫羧酶、二甲丙烯基轉(zhuǎn)移酶、法呢醇焦磷酸合成酶有關(guān)的下調(diào)基因，分別為c41539.graph_c0(-1.18);c31761.graph_c0(-2.08);c31761.graph_c1(-2.20); c41096.graph_c0(-1.87);c22737.graph_c0(-1.21);c11481.graph_c0(-1.35);c20493.graph_c0(-1.76)。并由其在通路中的下調(diào)表現(xiàn)，推導(dǎo)出這些基因