Z-DNA在基因組中的分布及其與結(jié)腸癌拷貝數(shù)變異的潛在關(guān)系.pdf

1、生物體內(nèi)天然狀態(tài)的雙鏈DNA幾乎都是以B構(gòu)型DNA(B-DNA)存在，也就是沃森克里克在1953年發(fā)現(xiàn)的右手雙螺旋DNA結(jié)構(gòu)。右手雙螺旋DNA理論的提出標(biāo)志著現(xiàn)代分子生物學(xué)的誕生。之后的二十多年間分子生物學(xué)家一直把DNA視為在結(jié)構(gòu)上遵循B-DNA模型的靜態(tài)分子。直到1979年Rich等人通過高分辨率的單晶體X射線衍射技術(shù)第一次發(fā)現(xiàn)了Z-DNA(Z conformation DNA，又稱左手螺旋DNA)，科學(xué)家們才認(rèn)識到DNA的構(gòu)象其實是

2、多種構(gòu)象之間的動態(tài)平衡。
　　但是關(guān)于Z-DNA的研究進(jìn)展緩慢，在之后的幾年里，這個具有特殊結(jié)構(gòu)的生物分子的生物學(xué)意義受到了分子生物學(xué)家的廣泛質(zhì)疑。從事Z-DNA構(gòu)象和功能研究的實驗室逐漸減少，以至于上世紀(jì)八十年代后期到九十年代初期科學(xué)家對Z-DNA的科研興趣越來越小。隨著近二十年來Z-DNA在生物學(xué)過程和諸多疾病發(fā)生機(jī)制中的潛在作用逐漸被揭示，有關(guān)Z-DNA的研究開始引起越來越多實驗生物學(xué)家的關(guān)注。
　　一般認(rèn)為，當(dāng)DNA

3、片段從B構(gòu)象到Z構(gòu)象的轉(zhuǎn)換(B-to-Z transition)過程中DNA負(fù)超螺旋(Negative Supercoiling)解旋釋放能量，DNA吸收能量使得核苷酸發(fā)生構(gòu)象改變形成反順交替的結(jié)構(gòu)，因此Z-DNA構(gòu)象是一種高能狀態(tài)，且其存在時間很短所以又是瞬時的行為，當(dāng)它行使功能后便釋放能量從高能狀態(tài)下的Z-DNA恢復(fù)成穩(wěn)定低能狀態(tài)下的B-DNA構(gòu)象。由于以上原因，它很難在體內(nèi)被準(zhǔn)確地捕捉和定位，且?guī)追NZ-DNA結(jié)合蛋白的識別效率較低

4、，通過實驗方法檢測的效果不佳。綜上所述，通過Z-DNA的序列特征和結(jié)構(gòu)特征，采用生物信息學(xué)的方法來對其進(jìn)行預(yù)測則是一個較為可行的辦法。預(yù)測得到的結(jié)果不但可以在基因組的尺度上了解Z-DNA的特征，探索ZDRs的分布，還可對Z-DNA生物學(xué)功能的研究起到輔助作用。這些都是本研究的出發(fā)點和落腳點。
　　已知Z-DNA的分布與一些疾病的染色體斷裂點的分布一致，但至今無人對Z-DNA與癌癥拷貝數(shù)變異的潛在關(guān)系進(jìn)行研究。
　　本研究目的

5、是:
　　1.通過改進(jìn)Z-Catcher以提供切實可行、方便快捷的Z-DNA預(yù)測的生物信息學(xué)方法;
　　2.探索Z-DNA潛在區(qū)域在人類基因組和模式生物基因組中的分布;
　　3.對Z-Catcher2的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行整理、綜合構(gòu)建數(shù)據(jù)庫和Z-DNA網(wǎng)站來供給對Z-DNA感興趣的科研人員查詢、下載使用;
　　4.尋找Z-DNA與結(jié)腸癌拷貝數(shù)變異的潛在聯(lián)系。
　　本研究內(nèi)容主要分為以下四個部分:
　　第一部

6、分:Z-DNA潛在區(qū)域的預(yù)測方法和Z-Catcher2的提出。
　　Z-Catcher2相對于其它已有方法有三個優(yōu)點:第一，輸入序列可以是任意長度的片段，可以是一段基因區(qū)域，一條染色體或者是整個基因組文件，且同一文件中可以有多條查詢序列。第二，輸出的Z-DNA潛在區(qū)域長度為大于等于12bps（初始滑窗長度）的序列，因為Z-Catcher2的搜索策略是搜索出盡可能長的不間斷的Z-DNA區(qū)域，以負(fù)超螺旋密度(σ0)為閾值來判斷查詢序列

7、是否滿足形成Z-DNA所需的能量。第三，程序運行快，對人類基因組序列進(jìn)行一次Z-Catcher2掃描大概需要15小時左右。
　　對Z-Catcher2預(yù)測結(jié)果的驗證方面，使用了經(jīng)典Z-DNA片段來測試Z-Catcher2的準(zhǔn)確性。對人類c-MYC基因的三個已知Z-DNA片段Z1，Z2和Z3進(jìn)行預(yù)測，當(dāng)σ0=-0.075時可以檢測到Z2片段，當(dāng)σ0=-0.08時可以檢測到Z1、Z2片段，當(dāng)σ0=-0.09時可以同時檢測到Z1、Z2、

8、Z3，三個片段。通過比較使用nBMST在人類基因組(version hg19)中的運行結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)σ0=-0.07時，Z-Catcher2預(yù)測的Z-DNA潛在區(qū)域結(jié)果中有66.88％同nBMST預(yù)測結(jié)果的68.56％有重疊。當(dāng)σ0=-0.075時，Z-Catcher2預(yù)測的Z-DNA潛在區(qū)域結(jié)果覆蓋了86％的nBMST預(yù)測結(jié)果。剩余未重疊部分則可能是因為nBMST方法未加入Z-DNA的熱動力特征所產(chǎn)生的差異。
　　第二部分:利用Z

9、-Catcher2探索Z-DNA潛在區(qū)域在人類基因組以及模式生物基因組中的分布。
　　本章使用Z-Catcher2對人類基因組(version hg38)，人類近緣的黑猩猩基因組，模式生物基因組（果蠅、秀麗線蟲、大鼠、小鼠、斑馬魚、啤酒酵母、擬南芥）進(jìn)行了Z-DNA的分析。在人類基因組中得到了幾個重要結(jié)果。首先，Z-DNA潛在區(qū)域在基因組中的分布同GC含量雖然具有一定的正相關(guān)性，但也有些GC含量較高的染色體中ZDRs的含量相對較低

10、，而一些GC含量較低的染色體中卻含有較多的ZDRs。在對其它模式生物的ZDRs預(yù)測結(jié)果和GC含量的考查中同樣發(fā)現(xiàn)，二者之間雖具有相關(guān)性但這樣的相關(guān)性并不具有統(tǒng)計學(xué)意義，比如小鼠、大鼠基因組的GC含量只比人類和黑猩猩基因組的略高，但其預(yù)測得到的ZDRs數(shù)量卻是前兩者的2倍多。其次，人類基因組中預(yù)測得到的ZDRs長度分布與隨機(jī)序列上ZDRs的長度分布明顯不同，人類的ZDRs長度大于41 bps的約占40％，而隨機(jī)序列上的ZDRs長度大于41

11、 bps的序列則只占了0.8％，77.8％的隨機(jī)序列上的ZDRs長度在12～20 bps之間。再次，Z-DNA潛在區(qū)域明顯富集在編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點附近，并且Z-DNA潛在區(qū)域在非編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點附近則未見明顯富集現(xiàn)象。最后，編碼蛋白基因里的外顯子中ZDRs的含量顯著高于內(nèi)含子中ZDRs的含量。在考查了其它基因組后發(fā)現(xiàn)，除了與人類近緣的黑猩猩基因組中出現(xiàn)類似人類的外顯子和內(nèi)含子所含ZDRs存在差異的現(xiàn)象之外，其余模式生物都不存在

12、這種現(xiàn)象。另外，在長鏈非編碼RNA中ZDRs的密度與編碼蛋白基因內(nèi)含子中ZDRs的密度相似，但其顯著低于外顯子中ZDRs的密度。
　　第三部分:Z-DNA潛在區(qū)域數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建、網(wǎng)頁查詢以及數(shù)據(jù)下載。
　　本部分中，對Z-Catcher2在各個模式生物基因組中得到的Z-DNA潛在區(qū)域的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理綜合，然后建立動態(tài)查詢網(wǎng)頁，面向科研工作者提供Z-Catcher2得到的Z-DNA潛在區(qū)域結(jié)果和Z-Catcher2程序本身的下載。

13、因為Z-DNA潛在區(qū)域的結(jié)果相對簡單，不涉及二維表之間的關(guān)聯(lián)所以使用輕型開源的SQLite軟件來構(gòu)建數(shù)據(jù)庫。另外SQLite數(shù)據(jù)庫和R語言平臺的連接非常方便，R中有專門連接SQLite的程序包。動態(tài)網(wǎng)頁的制作則使用R語言平臺下的Shiny package。Shiny是一款出自Rstudio公司的在R平臺下功能強大的動態(tài)網(wǎng)頁制作的程序包。動態(tài)網(wǎng)頁被分成前端的UI界面和后端的SERVER服務(wù)器兩個單獨的R腳本。使用Shiny包可以快速地制作

14、出美觀實用的動態(tài)網(wǎng)頁，省去了理解HTML文件、美化網(wǎng)頁等繁瑣操作，繼而可以專心于數(shù)據(jù)處理和對處理結(jié)果的呈現(xiàn)，目前該軟件包已經(jīng)成為炙手可熱的網(wǎng)頁制作新方法。
　　第四部分:探索Z-DNA與結(jié)腸癌拷貝數(shù)變異的潛在聯(lián)系。
　　Z-DNA的已知生物學(xué)功能除了與基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)外，就是能夠引起染色質(zhì)的遺傳不穩(wěn)定性。在哺乳動物中，CG、GT等低拷貝重復(fù)區(qū)域能夠引起附近序列發(fā)生大片段的缺失、染色體重排現(xiàn)象;而且這些區(qū)域也與一些疾病中發(fā)現(xiàn)的

15、DNA序列斷裂點高度一致。另外染色體二級結(jié)構(gòu)的變化能夠引起染色體的拷貝數(shù)變異現(xiàn)象，致病的拷貝數(shù)變異區(qū)域（大片段的缺失和擴(kuò)增）常見于癌癥病人中。但Z-DNA與癌癥拷貝數(shù)變異的關(guān)系還未見報導(dǎo)。
　　本部分研究使用已知可信的結(jié)腸癌拷貝數(shù)變異峰值區(qū)域，通過計算峰值區(qū)域內(nèi)ZDRs的密度與整條染色體內(nèi)ZDR密度的差異來探索Z-DNA與結(jié)腸癌拷貝數(shù)變異的潛在聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)17個顯著擴(kuò)增的CNV峰值區(qū)域中有13個ZDR密度明顯高于染色體ZDR密度;2

16、8個顯著缺失的CNV峰值區(qū)域中有15個ZDR密度顯著高于染色體ZDR密度;與結(jié)腸癌腫瘤惡性程度高度相關(guān)的15個CNV峰值區(qū)域中有12個區(qū)域出現(xiàn)ZDRs富集現(xiàn)象，這提示我們ZDR富集現(xiàn)象使得這些存在癌基因和抑癌基因的區(qū)域內(nèi)由ZDRs引起的遺傳不穩(wěn)定事件發(fā)生的頻率變高，或者說該區(qū)域本身就是遺傳不穩(wěn)定事件發(fā)生的高頻區(qū)，異常的CNV改變了這些基因的表達(dá)情況從而也就在根本上促進(jìn)了癌癥的發(fā)生以及發(fā)展。
　　綜上所述，因為Z-DNA的特殊結(jié)構(gòu)和

17、高能瞬時構(gòu)象使得科研人員對Z-DNA片段本身的探索變得非常困難，有必要采用生物信息預(yù)測的方法來對Z-DNA的潛在區(qū)域進(jìn)行預(yù)測和分析，從而為Z-DNA生物學(xué)功能的研究奠定基石。本課題屬于Z-DNA方面的基礎(chǔ)研究，以Z-DNA的預(yù)測和探索Z-DNA潛在區(qū)域在基因組中的分布及其與結(jié)腸癌拷貝數(shù)變異的潛在關(guān)系為研究目的。首先，在本研究組前期工作的基礎(chǔ)上開發(fā)了一個新穎的預(yù)測Z-DNA潛在區(qū)域的方法并且使用Perl語言實現(xiàn)該方法，命名Z-Catche

18、r2。其次，使用Z-Catcher2對人類基因組和其他模式生物基因組進(jìn)行ZDR的預(yù)測并且探索了ZDR在基因組中的分布。再次，綜合了已有各模式生物基因組中ZDR數(shù)據(jù)，使用R語言平臺構(gòu)建關(guān)于Z-DNA的動態(tài)查詢網(wǎng)頁并提供Z-Catcher2程序的下載，這填補了現(xiàn)階段Z-DNA數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)頁查詢的空白。最后通過計算結(jié)腸癌CNV峰值區(qū)域中ZDRs密度和區(qū)域邊界附近ZDR數(shù)量發(fā)現(xiàn)了ZDR的分布于結(jié)腸癌CNV的潛在聯(lián)系。希望本課題所做的基礎(chǔ)研究能夠為