蝶蛹金小蜂cDNA文庫抗菌肽基因篩選及表達(dá)研究.pdf

1、抗菌肽因其獨(dú)特的生物活性以及不同于傳統(tǒng)抗生素的特殊作用機(jī)理,引起了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。本研究針對(duì)傳統(tǒng)抗菌肽基因的克隆與篩選技術(shù)耗時(shí),費(fèi)錢,效率較低,對(duì)蛋白/肽純化要求高,以及難以發(fā)現(xiàn)新抗菌肽等的技術(shù)問題,建立了能篩選出具有抗菌活性的蛋白/肽及其基因的高效克隆篩選技術(shù)。
　　 1.建立了蝶蛹金小蜂cDNA表達(dá)性文庫,再篩選cDNA文庫中具有抗菌活性的DNA序列。經(jīng)核苷酸測(cè)序和序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所得到的陽性克隆所編碼的產(chǎn)物主要是未

2、見報(bào)道的新的短肽。同時(shí),也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)含有和蜜蜂的抗菌肽abaecin(Casteels et al.,1989)具有50％同源性的區(qū)域的陽性克隆PP30以及3個(gè)含有編碼核糖體蛋白的序列的克隆(PP7、PP55、PP224)。
　　 2.選取四個(gè)短肽(PP13、PP30、PP102、PP113)用于人工合成,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這四個(gè)短肽對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都表現(xiàn)出了不同的抗菌活性,MIC值從PP13對(duì)S.lutea的8.0μM到PP

3、102對(duì)Ecoli的166.7μM。本研究也檢測(cè)了不同濃度的抗菌肽(0-250μM)對(duì)小鼠血紅細(xì)胞的溶血性。經(jīng)過1小時(shí)的孵育,當(dāng)抗菌肽濃度達(dá)到125gM時(shí)觀察到很少比例的血細(xì)胞溶解,說明了這些抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是安全的。選擇NaCl用以測(cè)定這四個(gè)抗菌肽的抗菌活性受鹽離子濃度的影響。和其他部分抗菌肽一樣(Zasloff,2002),這四個(gè)抗菌肽對(duì)大腸桿菌的活性隨著NaCl濃度的增加而降低。
　　 3.使用透射電鏡觀察的方法,初步

4、測(cè)定所合成的蝶蛹金小蜂的抗菌肽對(duì)大腸桿菌的靶標(biāo)位點(diǎn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過抗菌肽PP13處理的大腸桿菌細(xì)胞和正常的細(xì)胞相比,細(xì)胞膜受到了嚴(yán)重的損傷。這和最初篩選可能編碼抗菌肽的cDNA序列時(shí)采用的染色方法的原理是一致的。正是由于這些抗菌肽作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜,引起細(xì)胞膜形成空洞甚至裂解,才使得染料分子進(jìn)入宿主細(xì)胞,從而發(fā)生染色反應(yīng)。
　　 4.本實(shí)驗(yàn)采用CD譜測(cè)定了合成的抗菌肽在10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)、50％TFE和25mM

5、 SDS水溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,所有的抗菌肽在10mM磷酸鈉緩沖液中都沒有確定的二級(jí)結(jié)構(gòu),以無規(guī)則線團(tuán)形式存在。而在50％TFE溶液中,PP13、PP113的α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量都達(dá)到了100％,PP102的α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量為53.5％,在25mM SDS的水溶液中,PP13的α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量為100％。
　　 5.將PP30基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pTRX/BL21中進(jìn)行表達(dá),獲得了高效表達(dá)的可溶性融合蛋白His-PP3