MicroRNA-187調控多靶點通過參與TGFβ介導上皮間質轉化抑制結直腸癌的轉移.pdf

1、結直腸癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率和死亡率均位居前五。
　　上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是腫瘤轉移的重要機制之一，通過下調上皮標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等，上調間質標志物波形蛋白(Vimentin)等，使細胞失去上皮極性，獲得更好的侵襲能力和運動能力，從而實現(xiàn)腫瘤的遠處轉移。轉化生長因子β(TGFβ)是EMT的重要調節(jié)因子，通過Sma

2、d依賴和非依賴途徑促進腫瘤EMT。因此，TGFβ/EMT網(wǎng)絡可能是結直腸癌轉移的關鍵機制。
　　研究目的：
　　本研究旨在探討miR-187及其靶基因SOX4、NT5E、PTK6如何參與TGFβ介導EMT的分子機制，為將來選擇性干預miR-187及其靶基因治療轉移性結直腸癌提供實驗依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.miR-187在結直腸癌組織和細胞中的表達
　　2.miR-187對結直腸癌細胞體內外生物學特性

3、的影響
　　3.miR-187參與TGFβ介導的EMT的機制研究
　　4.miR-187靶基因的篩選與鑒定
　　5.統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　研究結果：
　　1.miR-187在結直腸癌組織和細胞中的表達
　　(1)miR-187在結直腸癌組織和細胞中表達下調
　　在GEO(Gene Expression Omnibus，GSE49246)對結直腸癌組

4、織microRNA芯片進行分析，在40對結直腸癌組織中，與癌旁正常組織相比，有32對癌組織中miR-187表達下調。熒光定量RT-PCR結果顯示，35對新鮮的結直腸癌組織與配對正常組織相比，miR-187在癌組織中表達低于正常配對組織(P＜0.05)，并且在有淋巴結轉移的癌組織中，與未檢測到有淋巴結轉移的癌組織相比，miR-187的表達更低(P=0.001)。與正常結腸上皮細胞NCM460相比，miR-187在結直腸癌細胞中的表達下調(

5、P＜0.05)。
　　(2)miR-187與患者不良預后相關
　　通過對119例有完整隨訪資料的結直腸癌石蠟包埋組織進行原位雜交檢測miR-187的表達，并結合患者臨床資料進行臨床病理學參數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，患者的性別、年齡、腫瘤的位置和大小、分化程度、及TNM分期與miR-187的表達均無關系(P=0.164; P=0.476; P=0.744; P=0.197; P=0.575; P=0.379; P=0.272;P=0.771

6、)。生存分析表明miR-187低表達與患者不良預后密切相關(P=0.016)，采用COX比例風險模型評估臨床病理學參數(shù)與患者總生存期的關系發(fā)現(xiàn)，患者總生存期與腫瘤分化程度、N及M分期、miR-187的表達有關(P＜0.005;P＜0.01;P=0.001，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　以上實驗說明，miR-187在結直腸癌中低表達，并與患者不良預后相關，有望作為獨立預測指標判斷結直腸癌患者的預后。
　　2.miR-

7、187抑制結直腸癌細胞體內外增殖、遷移、運動和體內肺定植能力
　　(1)miR-187抑制結直腸癌細胞體外增殖、遷移和運動能力
　　(2)miR-187抑制結直腸癌細胞體內增殖和肺定植能力
　　3.TGFβ調控miR-187激活Smad通路介導EMT的發(fā)生
　　(1)miR-187抑制EMT的發(fā)生
　　(2)miR-187參與TGFβ/Smad通路
　　4.miR-187靶向SOX4、NT5E、PTK

8、6
　　(1)miR-187相關靶基因的預測
　　對SW480、RKO細胞miR-187基因芯片結果結合生物信息在線網(wǎng)站TargetScan、Pictar和miRanda取交集預測出114個miR-187的候選靶基因，對這114個基因進行基因本體分析及KEGG通路分析初步篩選出27個靶基因進行熒光定量RT-PCR檢測，結果顯示SOX4、NT5E、PTK6在過表達miR-187的細胞中下調(t=5.798，P＜0.005; t

9、=3.783，P＜0.05; t=5.357; P＜0.01)。
　　(2)miR-187靶基因的鑒定
　　成功構建wt SOX4/NT5E/PTK63'UTR和mut SOX4/NT5E/PTK63'UTR雙熒光素酶報告載體。將以上質粒與對照質粒psiCHECK-2分別與miR-187mimics共轉染293T細胞后檢測熒光素酶活性，結果顯示psiCHECK-2+mimics熒光素酶相對活性分別為1.000±0.153，1

10、.000±0.222，1.000±0.151; wtSOX4/NT5E/PTK63'UTR+ mimics熒光素酶相對活性分別為0.634±0.054，0.456±0.032，0.627±0.015; mut SOX4/NT5E/PTK63'UTR+ mimics熒光素酶相對活性分別為0.957±0.176，0.806±0.088，0.928±0.198，差異均具有統(tǒng)計學意義(F=6.306，P＜0.05; F=11.737，P＜0.0

11、1;F=9.080，P＜0.05)。對照質粒psiCHECK-2與突變質粒mut SOX4/NT5E/PTK63'UTR與miR-187共轉染均沒有改變熒光素酶的活性，表明miR-187與SOX4/NT5E/PTK63'UTR可特異性結合。Western Blot和免疫熒光結果顯示，過表達miR-187后SOX4、NT5E、PTK6表達下調。
　　(3)miR-187靶基因的功能與機制
　　在SW480/LV-miR-187

12、和RKO/LV-miR-187細胞中分別轉入SOX4、NT5E、PTK6的ORF克隆載體，Transwell細胞遷移實驗結果顯示，Mock組、control組、mimics組、mimics+SOX4組、mimics+NT5E組、mimics+PTK6組細胞的遷移能力具有顯著差異(F=29.368，P＜0.001;F=44.690，P＜0.001)。多重結果比較表明，過表達miR-187使SW480和RKO細胞體外遷移能力降低(P＜0.0

13、01;P＜0.001)，恢復靶基因SOX4、NT5E、PTK6的表達后SW480和RKO細胞體外遷移能力得到恢復(P=0.001，P＜0.001，P＜0.001;P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)。
　　在SW480和RKO細胞中進行如下轉染處理: mock、control、miR-187mimics、miR-187 mimics+SOX4/NT5E/PTK6共轉染，48h后收細胞進行WesternBlot，結果顯示

14、單獨轉染miR-187 mimics后EMT上皮標志物(E-cadherin，β-catenin)表達增加，間質標志物(fibronectin，vimentin)表達降低，Smad信號通路被制;與單獨轉染miR-187 mimics相比，miR-187 mimics+SOX4/NT5E/PTK6共轉染組EMT上皮標志物(E-cadherin，β-catenin)表達降低，間質標志物（fibronectin，vimentin）表達增加，S

15、mad信號通路活化，miR-187抑制EMT及Smad通路的作用被部分逆轉。
　　研究結論：
　　1、miR-187在結直腸癌組織和細胞中低表達，與患者不良預后密切相關，初步推斷miR-187在結直腸癌中扮演著抑癌基因的作用;
　　2、miR-187抑制結直腸癌細胞體內外增殖、遷移、運動和肺定植能力;
　　3、TGFβ調控miR-187激活Smad通路介導EMT;
　　4、miR-187靶向SOX4、NT5