卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對(duì)卵子特異性基因表達(dá)的影響.pdf

1、近年來(lái)輔助生育技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）及其衍生技術(shù)迅速發(fā)展，從最初的體外受精-胚胎培養(yǎng)（IVF-ET），到逐漸發(fā)展成熟的單精子卵泡漿內(nèi)注射（ICSI）、冷凍胚胎移植（FET），再到近年來(lái)不斷推廣應(yīng)用的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查（PGD/PGS）等，生殖相關(guān)技術(shù)難題逐漸得到攻克，并使越來(lái)越多的不孕不育夫婦從中受益。
　　配子和胚胎冷凍技術(shù)是生育力保存和輔助生殖領(lǐng)域的重要組成部分

2、，其中胚胎的程序化冷凍和玻璃化冷凍目前已常規(guī)應(yīng)用于世界各地的輔助生育中心，而卵母細(xì)胞因其體積大、含水量多、細(xì)胞核無(wú)核膜包繞保護(hù)、膜的滲透性低等特點(diǎn)，被相關(guān)領(lǐng)域研究者認(rèn)為是最難成功凍融的細(xì)胞類型。既往多項(xiàng)研究表明，在卵母細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇中，玻璃化冷凍技術(shù)較程序化慢速冷凍技術(shù)更為高效，由此可見，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)的成功應(yīng)用不僅對(duì)人類輔助生育技術(shù)的完善和發(fā)展有重要意義，對(duì)核移植工程和珍稀物種生殖資源的保存亦有重要推進(jìn)作用。
　　玻璃

3、化冷凍技術(shù)是應(yīng)用高濃度冷凍保護(hù)劑置換胞液中的水分，使細(xì)胞在超速冷凍降溫過(guò)程中避免胞內(nèi)冰晶形成進(jìn)而導(dǎo)致冷凍損傷的技術(shù)。然而，卵母細(xì)胞超快速凍融過(guò)程和玻璃化冷凍保護(hù)劑本身均會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)及附屬結(jié)構(gòu)（如透明帶、紡錘體、細(xì)胞骨架等）帶來(lái)一定損傷，進(jìn)而影響復(fù)蘇率、體外受精后的受精率及早期胚胎發(fā)育潛能。國(guó)內(nèi)外在卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)領(lǐng)域的研究多集中于比較兩種冷凍方法（程序化慢速冷凍及玻璃化冷凍）或不同冷凍載體的冷凍效率、冷凍復(fù)蘇體系的建立和改進(jìn)

4、等方面，針對(duì)冷凍技術(shù)對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生影響的具體機(jī)制如基因表達(dá)、表觀遺傳修飾等方面則研究較少。卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因是一類卵母細(xì)胞內(nèi)特有的、參與卵泡生成與成熟、受精與早期胚胎發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵基因。而目前國(guó)內(nèi)外將這類基因表達(dá)結(jié)合玻璃化冷凍技術(shù)的研究很少。本研究將成熟期（MII）卵母細(xì)胞分別行冷凍-復(fù)蘇液處理和玻璃化冷凍-復(fù)蘇，與新鮮 MII卵母細(xì)胞比較體外受精后早期胚胎發(fā)育情況及卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因 H1foo、Bmp15、Gdf9、

5、Sohlh2、Nobox表達(dá)水平，探索玻璃化冷凍-復(fù)蘇液毒性及玻璃化冷凍-復(fù)蘇技術(shù)對(duì)小鼠成熟期卵母細(xì)胞體外受精后早期胚胎發(fā)育潛能及卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響，并通過(guò)比較H1foo-α基因在新鮮及玻璃化冷凍-復(fù)蘇后MII期卵母細(xì)胞中的甲基化水平差異，初步探索玻璃化冷凍影響卵子特異性組蛋白H1foo表達(dá)的機(jī)制。
　　本研究首先將C57BL/6小鼠成熟期卵母細(xì)胞隨機(jī)分為新鮮對(duì)照組、冷凍復(fù)蘇液處理組及玻璃化冷凍復(fù)蘇組，各組分別取

6、40枚進(jìn)行卵子特異性基因 H1foo、Bmp15、Gdf9、Sohlh2、Nobox的mRNA表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn) H1foo亞型 H1foo-α在冷凍復(fù)蘇組的表達(dá)顯著低于冷凍復(fù)蘇液處理組及新鮮對(duì)照組(P＜0.05)，而另一亞型 H1foo-β及其他四個(gè)卵子特異性基因Bmp15、Gdf9、Sohlh2和Nobox的mRNA表達(dá)在組間無(wú)顯著差異（P>0.05）。應(yīng)用western blot實(shí)驗(yàn)研究H1foo的蛋白表達(dá)水平在新鮮組及玻璃化冷凍復(fù)蘇

7、組是否有差異，結(jié)果顯示，與Real-time PCR結(jié)果一致，H1foo-α的蛋白表達(dá)水平在玻璃化冷凍復(fù)蘇組顯著低于新鮮組。
　　進(jìn)一步檢測(cè)H1foo基因啟動(dòng)序列的甲基化程度，發(fā)現(xiàn)在該測(cè)序區(qū)段內(nèi)，玻璃化冷凍組100枚MII期卵母細(xì)胞的甲基化程度（87.5％）較新鮮組100枚MII期卵母細(xì)胞的甲基化程度（75%）高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　在第二部分實(shí)驗(yàn)中，197枚成熟期卵母細(xì)胞隨機(jī)分為三組，新鮮對(duì)照組64枚

8、，冷凍復(fù)蘇液處理組65枚，玻璃化冷凍復(fù)蘇組68枚，行體外受精比較三組卵母細(xì)胞所獲早期胚胎的2-細(xì)胞率及囊胚率。應(yīng)用冷凍-復(fù)蘇液處理后的卵母細(xì)胞體外受精后，其2-細(xì)胞率（卵裂率）與囊胚率分別為77.42%及56.25%，與新鮮對(duì)照組2-細(xì)胞率（81.25%）及囊胚率（57.7%）相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。而冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞體外受精后，其2-細(xì)胞率（63.93%）較新鮮對(duì)照組及冷凍復(fù)蘇液處理組均顯著下降(P＜0.05)，而囊胚率

9、（53.84%）較新鮮組及冷凍復(fù)蘇液處理組有下降趨勢(shì)，而差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍-復(fù)蘇液對(duì)卵母細(xì)胞體外受精后卵子特異性基因表達(dá)及早期胚胎發(fā)育無(wú)顯著影響（P>0.05），而冷凍復(fù)蘇這一過(guò)程會(huì)降低H1foo-αmRNA和蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）及體外受精后2-細(xì)胞率（P＜0.05），在對(duì)改變H1foo表達(dá)機(jī)制的初步研究中發(fā)現(xiàn)，H1foo在玻璃化冷凍-復(fù)蘇后的甲基化程度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)