組蛋白去乙?；?調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡機制研究.pdf

1、目的：
　　大量研究表明，許多急性和慢性腦損傷疾病，包括缺血性腦中風、癲癇及某些神經(jīng)退行性疾病，都與NMDA受體介導的神經(jīng)細胞死亡相關(guān)聯(lián)。NMDA受體復合體包含一個能夠優(yōu)先透過Ca2+的離子通道。NMDA受體的過度激活可能會造成細胞內(nèi)鈣的過載，進而引發(fā)酶促級聯(lián)反應事件最終導致細胞死亡。第二類鈣離子/鈣調(diào)素依賴性的蛋白激酶（CaMKⅡ）是一種常見Ca2+整合器，與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)聯(lián)。而組蛋白去乙酰化酶5(HDAC5)正是CaMKⅡ激活后

2、的重要靶蛋白，這提示我們HDAC5在細胞凋亡中可能起到重要作用。
　　組蛋白去乙?；?HDAC)是一類能夠通過調(diào)節(jié)組蛋白及非組蛋白乙?；蕉刂迫旧|(zhì)結(jié)構(gòu)及基因表達的酶，其中第二類HDAC在腦的發(fā)育和神經(jīng)元存活方面發(fā)揮著重要作用。第二類HDAC(HDAC4，5，7，9)能夠在多種組織中特異性表達，其中在腦和骨骼肌中的表達量最高。一些第二類HDAC成員能夠依賴它們的磷酸化位點在細胞核與細胞質(zhì)之間穿梭。但是，HDAC在神經(jīng)退行性疾

3、病中發(fā)揮的作用目前仍不得而知。
　　因此，本研究利用激光共聚焦掃描顯微鏡、western blot、細胞轉(zhuǎn)染等技術(shù)，觀察了HDAC5在NMDA誘導的神經(jīng)元凋亡中的改變，探討了HDAC5在NMDA誘導的皮層神經(jīng)細胞凋亡中的作用及其作用機制。
　　方法：
　　1、大鼠胎鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)及鑒定。
　　2、共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)檢測NMDA等藥物處理后皮層神經(jīng)元中HDAC5的分布及磷酸化、CAMKⅡ磷酸化及組蛋白H

4、3乙酰化情況。
　　3、Western blot檢測NMDA等藥物處理后皮層神經(jīng)元中HDAC5的分布及磷酸化、CAMKⅡ磷酸化及組蛋白H3乙酰化情況。
　　4、利用磷酸鈣及電穿孔方法檢測HDAC5磷酸化缺陷型突變株HDAC5Z(S259A/S498A)對NMDA誘導的皮層神經(jīng)元凋亡的影響及CaMKⅡα活化型突變株CaMKⅡα(T286D)對HDAC5分布的影響。
　　結(jié)果：
　　一、HDAC5的出核轉(zhuǎn)運參與NMD

5、A誘導的皮層神經(jīng)元凋亡
　　1、共聚焦激光掃描顯微鏡檢測顯示，在正常的皮層神經(jīng)元中，HDAC5平均地分布于細胞核與細胞質(zhì)中，而NMDA處理誘導HDAC5出核轉(zhuǎn)運，但對HDAC4沒有影響。
　　2、Western blot結(jié)果顯示，NMDA誘導HDAC5出核轉(zhuǎn)運，但對HDAC4沒有影響。
　　3、Western blot結(jié)果顯示，用NMDA處理皮層神經(jīng)元，caspase-3的激活伴隨處理時間的增加而增加，而這種現(xiàn)象與HD

6、AC5在S259和S498位點的磷酸化水平的增加有關(guān)。
　　二、NMDA通過激活CaMKⅡ誘導HDAC5磷酸化及出核轉(zhuǎn)運
　　1、Western blot結(jié)果表明，NMDA處理增加了CaMKⅡα在T286位點的磷酸化程度，但CaMKⅡ抑制劑NK-93能夠抑制NMDA的這種作用，并減少了NMDA誘導的HDAC5 S259和S498的磷酸化。
　　2、免疫熒光結(jié)果顯示，預先用KN-93處理會抑制NMDA誘導的HDAC5的出

7、核轉(zhuǎn)運，而結(jié)構(gòu)性活化的CaMKⅡα(T286D)則會阻斷KN-93對皮層神經(jīng)元中HDAC5出核轉(zhuǎn)運的作用。
　　三、HDAC5的核定位能夠抑制NMDA誘導的皮層神經(jīng)元的凋亡
　　熒光顯微鏡和western blot的結(jié)果顯示，在NMDA誘導的凋亡神經(jīng)元中，野生型HDAC5發(fā)生出核轉(zhuǎn)運，而HDAC5的磷酸化缺陷突變體HDAC5S259A/S498A的分布沒有受到NMDA的影響，而這種HDAC5的核定位抑制了NMDA誘導的神經(jīng)細

8、胞凋亡。
　　四、組蛋白去乙酰化酶抑制劑促進NMDA誘導的皮層神經(jīng)元的凋亡
　　1、共聚焦激光掃描顯微鏡結(jié)果顯示，與單獨使用NMDA處理神經(jīng)元相比，預先用HDAC5的藥理抑制劑TSA處理神經(jīng)元能夠顯著增加TUNEL陽性細胞數(shù)。同時，TSA的預處理增加了NMDA誘導的組蛋白H3的高乙酰化。
　　2、Western blot結(jié)果顯示，TSA的預處理增加了NMDA誘導的caspase-3的激活及H3乙?；脑黾印?br>　　

9、五、NMDA誘導的組蛋白H3高乙酰化需要CaMKⅡα介導的HDAC5出核轉(zhuǎn)運
　　1、結(jié)果顯示，用NMDA處理增加了HDAC5(WT)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元中組蛋白H3的乙?；鳫DAC5的磷酸化缺陷突變體HDAC5S259A/S498A抑制了NMDA誘導的H3高乙?；?。
　　2、結(jié)果顯示，KN-93的預處理抑制了NMDA誘導的H3高乙?；Y(jié)構(gòu)性活化的CaMKⅡα(T286D)阻斷了KN-93對NMDA誘導的H3高乙?；囊种谱饔?/p>