一氧化氮在水分脅迫和脫落酸誘導(dǎo)玉米葉片抗氧化防護(hù)中的作用.pdf

1、植物激素脫落酸(abscisic acid,ASA)可以調(diào)節(jié)植物抗逆(包括干旱、冷害、鹽害等)的多種生理反應(yīng)和分子生物學(xué)效應(yīng)。一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種多功能生物活性分子,作為信號(hào)參與基因活化、蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性的調(diào)節(jié)使植物對(duì)逆境脅迫做出應(yīng)答。最近的研究表明ABA和水分脅迫都可以引起NO和過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)的產(chǎn)生,以及細(xì)胞質(zhì)Ca2+([Ca2+]i)和鈣調(diào)素(calmoduli

2、n,CaM)增加,誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá),提高植物抗氧化防護(hù)能力。NO在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)中起重要作用。然而,有關(guān)NO作為信號(hào)分子介導(dǎo)ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍有待闡明。本研究以玉米葉片為材料,研究了在ABA和水分脅迫誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)中NO的作用以及H2O2,Ca2+/CaM與NO之間的關(guān)系。主要的研究結(jié)果如下： 用NO特異的熒光染料4'5'-二氨基熒光素二乙酸酯(4,5-diaminofluorescein dia

3、cetate,DAF-2DA)對(duì)小決葉片進(jìn)行染色,并用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察熒光變化。10 mM CaCl2處理迅速誘導(dǎo)NO產(chǎn)生和NOS活性增加。CaCl2處理1 h時(shí)NO達(dá)到最大值并一直持續(xù)到2 h,2 h后開(kāi)始減弱。在CaCl2處理1 h時(shí),細(xì)胞溶質(zhì)和微粒體部分一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)活性達(dá)到最大值,分別比對(duì)照

4、增加了92.7％和148％。NO清除劑c-PTIO(2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide),NOS抑制劑L-NAME(NG-nitro-L-Arg methylester)、PBITU(S,S'-1,3-phenylene-bis(1,2-ethanediyl)-his-isothiourea)和CaM拮抗劑預(yù)處理都抑制了CaCl2誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生和

5、細(xì)胞溶質(zhì)及微粒體部分NOS活性增加。另一方面,Ca2+抑制劑和CaM拮抗劑預(yù)處理幾乎完全抑制了ABA和H2O2誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生和細(xì)胞溶質(zhì)及微粒體部分NOS活性的增加,表明玉米葉片中ABA和H2O2是通過(guò)Ca2+_CaM依賴型的NOS途徑誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的.研究還發(fā)現(xiàn)外源NO處理顯著提高了玉米葉片葉肉細(xì)胞[Ca2+]i、玉米葉片CaM1基因表達(dá)和CaM含量。NO清除劑c-PTIO和NOS抑制劑L-NAME預(yù)處理部分抑制了ABA處理后期[Ca2+

6、]i和CaM含量的提高,表明NO參與ABA誘導(dǎo)的Ca2+/CaM水平增加。此外,Ca2+鰲合劑、Ca2+通道阻塞劑和CaM拮抗劑預(yù)處理還顯著抑制了NO誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)基因SOD4、cAPX,GRl表達(dá)和葉綠體及細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化酶SOD、APX、GR活性的增加,說(shuō)明玉米葉片中NO誘導(dǎo)的Ca2+/CaM增加參與了NO誘導(dǎo)的亞細(xì)胞抗氧化防護(hù)系統(tǒng)。這些結(jié)果暗示了Ca2+/CaM作為NO的上游和下游信號(hào)分子參與ABA和H2O2誘導(dǎo)玉米葉片抗氧化防護(hù)

7、。水分脅迫處理能夠誘導(dǎo)玉米葉片葉肉細(xì)胞NO的產(chǎn)生。水分脅迫處理1 h時(shí)NO開(kāi)始產(chǎn)生,一直持續(xù)到4h達(dá)到最大,4 h后減弱。水分脅迫誘導(dǎo)了NOS活性增加,水分脅迫處理4 h時(shí)細(xì)胞溶質(zhì)部分NOS活性是對(duì)照的4.3倍,微粒體部分的NOS活性是對(duì)照的7.2倍。這些結(jié)果表明微粒體部分NOS活性比細(xì)胞溶質(zhì)部分高且更容易受到水分脅迫的影響。NOS抑制劑L-NAME和PBITU預(yù)處理顯著抑制了水分脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞溶質(zhì)和微粒體部分NOS活性的增加,而NO清

8、除劑c-PTIO和硝酸還原酶(nitrate reductase,NR)抑制劑KCN、NaN3抑制了水分脅迫誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生,但并不影響NOS活性。結(jié)果表明NOS是水分脅迫誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的主要來(lái)源,NR也部分參與了水分脅迫誘導(dǎo)的玉米葉片NO的產(chǎn)生。 分別用DAB(3,3-diaminobenzidine)染色的組織化學(xué)、分光光度計(jì)法和CeCl3染色的細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)了NO對(duì)水分脅迫誘導(dǎo)的H2O2累積的影響。結(jié)果顯示SNP提高了水分脅

9、迫誘導(dǎo)的葉綠體和細(xì)胞溶質(zhì)谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(astorbate peroxidase,APX)的活性,減少了水分脅迫誘導(dǎo)的H2O2的積累,而[Fe(III)CN]在一定程度上降低了亞細(xì)胞抗氧化防護(hù)酶的活性,不影響H2O2的積累。施用NO清除劑、NOS抑制劑和NR抑制劑的研究結(jié)果表明NO參與外源H2O2和

10、水分脅迫誘導(dǎo)的SOD4、cAPR,GRl的表達(dá)和葉綠體及細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)酶SOD、APX、GR活性的提高。這些結(jié)果表明NO能夠清除水分脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2至少部分歸因于NO誘導(dǎo)的不同亞細(xì)胞分隔抗氧化防護(hù)的協(xié)同作用。 對(duì)水分脅迫下ABA積累、Ca2+/CaM增加和NO產(chǎn)生之間的關(guān)系的研究結(jié)果顯示,水分脅迫積累的內(nèi)源ABA是水分脅迫誘導(dǎo)NO產(chǎn)生和激活NOS活性的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子；NO參與了水分脅迫誘導(dǎo)的ABA積累、[Ca2+]i提高

11、、CaM1基因表達(dá)和CaM含量的增加。另一方面,Ca2+抑制劑和CaM拮抗劑預(yù)處理幾乎完全抑制了水分脅迫誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生和細(xì)胞溶質(zhì)及微粒體部分NOS活性的增加,表明Ca2+/CaM介導(dǎo)了水分脅迫誘導(dǎo)的玉米葉片NO的產(chǎn)生。此外,研究還發(fā)現(xiàn)水分脅迫誘導(dǎo)葉綠體和線粒體NO產(chǎn)生,Ca2+鰲合劑和CaM拮抗劑預(yù)處理只抑制了水分脅迫誘導(dǎo)的線粒體NO產(chǎn)生而對(duì)葉綠體NO的產(chǎn)生沒(méi)有影響,表明在玉米葉片葉綠體和線粒體中合成NO的NOS種類(lèi)可能有所不同。