離子束介導大豆DNA轉(zhuǎn)化羊柴的初步研究.pdf

1、羊柴是我國特有的優(yōu)良牧草之一，也是防風固沙，改良土壤，改變小氣候，改善自然生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良物種。近些年來由于牲畜的增加，草場重牧，天然羊柴的數(shù)量越來越少，甚至在有些地方已經(jīng)絕跡。利用基因工程對羊柴進行遺傳改良具有重要實踐意義。目前如何建立一種有效的、穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，已成為羊柴分子生物學研究和基因工程研究的關(guān)鍵技術(shù)。 本論文著重研究如何以羊柴成熟胚為外植體建立組織培養(yǎng)體系，并對影響羊柴愈傷誘導率的因素作了初步研究。實驗

2、結(jié)果表明：以MS為基本培養(yǎng)基，在愈傷誘導培養(yǎng)基中加入2，4-D利于愈傷組織的誘導；加入6-BA可以明顯改善愈傷組織的質(zhì)量。最終確立誘導成熟胚愈傷組織的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基附加2，4-D(2mol/L)和6-BA(1.5mg/L)。 本實驗針對重組質(zhì)粒pBI121/Gy3上攜帶的Kan抗性基因，研究了抗生素的不同濃度對愈傷組織重量增長率的影響，確定了合適的抗生素篩選濃度為60mg/L，建立了有效的篩選體系。 在對離子注入

3、羊柴種子的研究過程中發(fā)現(xiàn)，離子能量對種子存活率有一定的影響，并通過研究羊柴種子的成活率和劑量的關(guān)系確定其轉(zhuǎn)化劑量范圍是800、900、1000×2.6×1013N+/cm2，通過實際轉(zhuǎn)化實驗確定最佳的轉(zhuǎn)化劑量為900×2.6×1013N+/cm2；對離子束注入后的羊柴愈傷組織進行失水率、愈傷組織重量增長倍數(shù)的統(tǒng)計以及細胞存活力的測定，確定了愈傷組織的轉(zhuǎn)化劑量范圍是100、150、200×2.6×1013N+/cm2，通過實際轉(zhuǎn)化實驗確定

4、最佳的轉(zhuǎn)化劑量為150×2.6×1013N+/cm2。在離子束介導轉(zhuǎn)化實驗中，用羊柴干種子和愈傷組織為受體，以GUS基因為篩選標記基因，目標基因為pBl121/Gy3，每個處理組注入約100個種子和20個愈傷組織，在誘導培養(yǎng)基中加入卡那霉素進行篩選，經(jīng)一個月后得到抗性愈傷組織。GUS檢測結(jié)果顯示：干種子檢測到的GUS基因的瞬間表達率為13％。在活體組織注入后可以存活的前提下，通過對離子束介導質(zhì)粒DNA導入羊柴愈傷組織的遺傳體系的研究，得