西安地區(qū)腸道病毒71型的分離鑒定及單克隆抗體的制備.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的成員,最初由Schmidt等從腦脊液中分離出來,世界上許多國家相繼報道了EV71病毒在不同地區(qū)流行情況,近來在我國也呈逐年上升趨勢,感染EV71后,除了可以引起手足口病、皰疹性咽峽炎以外,還可以導(dǎo)致無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)性肺水腫、心肌炎等疾病,嚴(yán)重威脅著兒童的生命健康。EV71病毒由60個相同的亞單位構(gòu)成,每個亞單位均包含VP1~V

2、P4四種結(jié)構(gòu)蛋白,據(jù)病毒衣殼蛋白VP1序列(891bp)的變異情況,將其分為A、B和C三個基因型,近年的研究表明[1],基因型B和C又可進(jìn)一步分為不同亞型(B1~B5和C1~C4)。目前對EV71的分子流行病學(xué)研究主要是VP1、VP4基因及5’-UTR區(qū)的變異,而VP1最具有研究價值,因為它直接決定病毒的抗原性,是病毒主要的中和決定因子,有遺傳變異多樣性的特點,5’-UTR結(jié)構(gòu)涉及病毒的宿主范圍和病毒的毒力等多個方面的功能。腸道病毒71

3、型遺傳學(xué)上具有多變性,同一地區(qū)不同時間流行的EV71易發(fā)生基因型轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致臨床癥狀在不同地區(qū)和不同時間均有差異。大多在一周內(nèi)可恢復(fù),但少數(shù)低齡患兒可能只表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀,增加了早期診斷的難度,目前,對EV71致病的分子機(jī)制了解還很少,通過何種受體進(jìn)入宿主細(xì)胞尚不明了,現(xiàn)在還沒有研制出安全有效的特效藥和疫苗,所以,對這種病原體及時快速的檢測對于手足口病的診治有著至關(guān)重要的作用。
　　目的:對西安地區(qū)腸道病毒71型流行株進(jìn)行

4、分離鑒定,經(jīng)初步提純,建立一種新的快速EV71抗體ELISA檢測方法,以提純獲得的EV71病毒作為抗原免疫小鼠,制備腸道病毒71型西安株單克隆抗體,構(gòu)建出穩(wěn)定分泌表達(dá)的雜交瘤細(xì)胞株,測定腹水效價,為以后研究EV71病毒的生物學(xué)功能及其早期診治防治奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.采集手足口病患兒咽部分泌物標(biāo)本進(jìn)行病毒分離和RT-PCR檢測,利用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行鑒定,并將提取的病毒RNA進(jìn)行核苷酸序列測定;2.用聚乙二醇(PEG)沉淀法將分

5、離的EV71病毒進(jìn)行初步濃縮、提純,獲得大量高濃度的EV71抗原,然后直接應(yīng)用抗原包被酶標(biāo)板,用已知EV17抗體陽性血清鑒定所提純抗原的免疫活性;3.用濃縮提純的EV71病毒作為免疫原免疫Balb/c小鼠,末次加強(qiáng)免疫后3天取脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合,用HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,經(jīng)過3次有限稀釋克隆化,ELISA反復(fù)篩選,獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株,接種于小鼠體內(nèi)制備含有單克隆抗體的腹水,并檢測腹水效價。
　

6、　結(jié)果:1.原始標(biāo)本直接用RT- PCR法擴(kuò)增,陽性7份,陽性率31.8％(7/22);接種于RD細(xì)胞后成功分離10份陽性標(biāo)本,陽性率為45.4％(10/22);然后運用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))從病毒培養(yǎng)上清中提取病毒RNA,發(fā)現(xiàn)病毒分離后再經(jīng)RT- PCR檢測的陽性率為68.1％,2.病毒分離后經(jīng)RT-PCR檢測陽性條帶切下測序,所得基因序列同GENEBAND報道的西安地區(qū)EV71流行株序列號(EU812461)完全一致,

7、免疫熒光鑒定結(jié)果陽性;3.分離提純的EV71病毒作為抗原直接包被酶標(biāo)板,檢測經(jīng)臨床鑒定的EV71感染患兒陽性血清20份,陽性率85％,檢測柯薩奇病毒抗體陽性血清均為陰性;4.反復(fù)篩選獲得2株穩(wěn)定分泌抗EV71單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株:EM1、EM2,經(jīng)過檢測腹水中抗體效價為10-4。
　　結(jié)論:1.EV71病毒在RD細(xì)胞中能很好的增殖,通過病毒培養(yǎng)能提高標(biāo)本中EV71的核酸檢出率,標(biāo)本在病毒分離前后的RT-PCR結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意