康寧霉素（Trichokonins）抗菌、抗腫瘤活性及作用機(jī)制.pdf

1、Peptaibols是一類(lèi)由非核糖體肽合成酶(NOn-Ribosomal Peptide Synthetases，NRPSs)合成的富含α-氨基異丁酸(Aib)、具α-螺旋結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)菌、真菌等有拮抗作用的一類(lèi)特殊的抗菌肽。Peptaibols具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：含有高比例的非蛋白質(zhì)氨基酸殘基，尤其是富含α-氨基異丁酸(Aib)；烷基化的N-末端(通常乙?；?和C-末端羥基化的氨基酸。Aib殘基的存在有利于形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，所有現(xiàn)在已知的

2、peptaibols都是高度螺旋化的，脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp)則促使螺旋的彎曲(bends)或結(jié)節(jié)(kinks)的形成。Peptaibols兩親性的結(jié)構(gòu)特性使多個(gè)分子在脂雙層膜上能夠形成電荷依賴(lài)的離子通道。但是到目前為止只有單體分子的晶體結(jié)構(gòu)被解析，因此只提出了其與脂膜相互作用的模型。目前對(duì)于peptaibols的研究也主要集中在對(duì)其結(jié)構(gòu)的解析和其與擬態(tài)膜的相互作用方面，而對(duì)于其抗菌性質(zhì)、抗腫瘤活性及其作用機(jī)制卻缺乏深入而廣

3、泛的研究?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的317種peptaibols中有190種來(lái)源于木霉菌株。木霉菌是一種廣泛存在于土壤、植物根際和葉面的腐生型真菌，對(duì)于多種植物病原真菌具有抑制作用，是一種重要的商業(yè)化生防因子。本課題組在對(duì)木霉生防因子Trichodermakoningii SMF2的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生耐熱性的抗菌物質(zhì)，且該抗菌物質(zhì)對(duì)多種土傳真菌具有拮抗作用。在此研究基礎(chǔ)上，本文分離純化鑒定了該抗菌物質(zhì)，并對(duì)其抗菌性質(zhì)及抗腫瘤活性進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。

4、 1.康寧霉素的分離、純化和鑒定。采用分子篩層析技術(shù)部分純化了T. koningii SMF2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，采用高效液相色譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步分離純化，結(jié)合抗菌活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)峰1，2和3的三個(gè)組分具有抑菌活性。采用液質(zhì)聯(lián)用(LC-ESI-MS)技術(shù)對(duì)三個(gè)組分進(jìn)行了鑒定，三種抗菌活性物質(zhì)鑒定為’rrichokonins(TrichokoninⅥ，Ⅶ和Ⅷ)，定名為康寧霉素。 2.康寧霉素的抗菌性質(zhì)研究。測(cè)定了康寧霉素的抑菌

5、譜，表明康寧霉素對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及多種植物病原真菌具有抑制作用，但對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌沒(méi)有作用。測(cè)定了康寧霉素對(duì)于金黃色葡萄球菌及一株臨床分離的多抗金黃色葡萄球菌的MIC值均為25μM，時(shí)間殺菌曲線表明在MIC藥物濃度下康寧霉素對(duì)二者的抗菌活性明顯不同。在含MIC濃度康寧霉素的培養(yǎng)基中多次傳代培養(yǎng)后，二者對(duì)藥物的敏感性發(fā)生了明顯的變化。 3.康寧霉素的抗腫瘤活性檢測(cè)。選取了有代表性的三株腫瘤細(xì)胞系：肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞Hep

6、G2及胃癌細(xì)胞BGC823作為受試細(xì)胞，初步研究了其抗腫瘤活性。MTT實(shí)驗(yàn)表明，康寧霉素對(duì)三者有著強(qiáng)烈的生長(zhǎng)抑制作用，IC50值均在25μM左右。康寧霉素具有明顯的腫瘤細(xì)胞毒性，很有可能成為有效的抗腫瘤候選藥物。熒光染色觀察的結(jié)果則表明：康寧霉素對(duì)三株細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制有所不同，各自表現(xiàn)出不同的特征。 4.研究了康寧霉素對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的機(jī)理。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)康寧霉素Ⅵ對(duì)HepG2細(xì)胞具有劑量依賴(lài)性的強(qiáng)烈抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)

7、果表明：康寧霉素Ⅵ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有paraptosis(副凋亡)的一些特征，如細(xì)胞大量死亡、線粒體破壞、以及胞質(zhì)不均質(zhì)化并伴有大量空泡的形成。同時(shí)，細(xì)胞死亡伴有DNA降解為較大片段以及線粒體跨膜電勢(shì)的破壞。研究表明康寧霉素Ⅵ可形成跨膜Ca<'2+>通道，因而很可能導(dǎo)致HepG2細(xì)胞胞內(nèi)Ca<'2+>濃度的迅速升高。Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，康寧霉素Ⅵ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過(guò)程中抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達(dá)水平下降，而caspase-9前