美洲商陸抗病毒蛋白基因轉(zhuǎn)化非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)的研究.pdf

1、美洲商陸抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein，PAP)是一種廣譜抗性蛋白，可以對抗多種植物病毒，如黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、煙草壞死病毒(Tobacco necrosis virus，TNV)、苜?；ㄈ~病毒(Alfalfa mosaicvirus，ALMV)、南方菜豆花葉病毒(Southern bean

2、 mosaic virus，SBMV)、馬鈴薯X病毒(Potatovirus X，PVX)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、花椰菜花葉病毒(Cauli flower mosaicvirus，CaMV)、非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic virus，ACMV)和蕪菁花葉病毒(Turnipmosaic virus，TuMV)等。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)可以使植物獲得廣譜抗性，從而

3、提高植株產(chǎn)量與質(zhì)量。
　　 非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)是當今世界各地廣泛栽培的著名切花。特別近幾年來，由于我國鮮切花用量劇增，其種植面積急劇擴大，并且由于非洲菊本身易感病毒病，非洲菊生產(chǎn)時的病害問題越來越嚴重。當其受到病毒侵害時容易使葉片褪綠、畸形，嚴重時導(dǎo)致死亡。傳統(tǒng)防治方法為噴灑農(nóng)藥，但是由于該法容易導(dǎo)致非洲菊上病毒耐藥、抗藥性的產(chǎn)生或農(nóng)藥噴灑不當而嚴重危害非洲菊的產(chǎn)量與質(zhì)量，而且農(nóng)藥的使用還會

4、造成環(huán)境的污染等問題。因此利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲取抗病毒植株對于今后培育出抗病非洲菊新品種具有現(xiàn)實意義。
　　 本研究通過建立高效的非洲菊再生以及遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將美洲商陸抗病毒蛋白基因轉(zhuǎn)入到非洲菊中，通過攻毒實驗以及酶活性測定顯示出一定抗性，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.非洲菊再生體系的建立
　　 通過選取無菌苗葉片和葉柄基部為外植體，以不同激素濃度配比誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽、以及根的發(fā)生，建立起非

5、洲菊的再生體系。結(jié)果顯示：以葉柄基部為適合外植體，MS+BA9.0mg/L+NAA0.1mg/L為最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基，MS+BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L為最佳誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基，1/2MS+NAA0.5 mg/L為最佳生根培養(yǎng)基。
　　 2.非洲菊轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 以非洲菊葉柄基部為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，OD600值為0.3的菌液濃度，侵染時間8 min，36 h的共

6、培養(yǎng)，延遲篩選2 d有利于獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+100umol/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)。延遲培養(yǎng)基MS+BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+頭孢霉素(Cefotaxime,Cef)500 mg/L。芽篩選培養(yǎng)基：MS+BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+潮霉素(Hygromicin.Hyg)13 mg/L+Cef500mg/L。根篩選培養(yǎng)

7、基：1/2MS+NAA0.5 mg/L+Hyg8mg/L+Cef500mg/L。
　　 3.轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及檢測
　　 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，潮霉素持續(xù)篩選和PCR檢測，在14株經(jīng)過潮霉素持續(xù)篩選的植株中有10株得到目的條帶，美洲商陸蛋白(PAP)基因成功轉(zhuǎn)入非洲菊幼苗。通過接種病毒后對植株形態(tài)的定期觀測有4株植株明顯表達出對病毒的抗性，生長正常。通過超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)的測定