KIM-1在白蛋白所致腎小管上皮細胞損傷中的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　慢性腎功能衰竭嚴重危害人類健康，如何延緩腎臟病進展是臨床醫(yī)生面臨的重要問題。在腎臟病進展過程中，蛋白尿所致腎小管損傷是非常重要的病理因素。腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)是新近發(fā)現(xiàn)的在腎小管上皮細胞表達的蛋白。目前研究證明KIM-1不僅僅是急性腎損傷的生物標志物，也參與慢性腎損傷。既往研究提示蛋白負荷腎病腎小管上皮細胞KIM-1表達增加，且與腎小管損傷密切相關，但機制尚不明

2、確。本研究利用體外培養(yǎng)的人近曲腎小管上皮細胞（HK-2）觀察在白蛋白所致腎小管損傷過程中KIM-1的表達情況，闡明在白蛋白所致HK-2細胞凋亡和上皮細胞-間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymaltransformation，EMT)過程中KIM-1的可能病理作用及機制。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)HK-2細胞，分別用不同濃度(5mg/ml、15mg/ml、20mg/ml)的人血白蛋白處理細胞不同時間(6h

3、、24h)，利用Western blotting檢測KIM-1的表達。
　　2、體外培養(yǎng)HK-2細胞，將細胞分為四組（A組:對照組; B組:HSA組;C組:空載-HSA組; D組:shRNA-HSA組）。制備KIM-1的shRNA質粒，用脂質體lipofectamineTM2000轉染HK-2細胞敲除KIM-1，給予白蛋白(20mg/ml)處理6h。通過Western blotting方法觀察KIM-1蛋白表達情況。通過流式細胞技

4、術以及Western blotting方法檢測bcl-2和Bax的表達評估HK-2細胞的凋亡情況。通過流式細胞術檢測活細胞內(nèi)ROS含量，比色法檢測超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量評估HK-2細胞的氧化應激程度。探討KMI-1在白蛋白所致HK-2細胞凋亡及氧化應激損傷中的可能作用。
　　3、體外培養(yǎng)HK-2細胞，將細胞分為四組（A組:對照組; B組:HSA組;C組:空載-HSA組; D組:KIM-1-HSA組）。制備KIM-1的過表達

5、載體，用脂質體lipofectamineTM2000轉染HK-2細胞使其過表達KIM-1，給予白蛋白(5mg/ml)處理24h。通過Westem blotting方法觀察KIM-1蛋白表達情況。通過光鏡檢測細胞形態(tài)變化，利用Western blotting方法檢測E-鈣黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達評估HK-2細胞EMT程度。通過Western blotting方法檢測p38MAPK磷酸化的程度。探

6、討KIM-1在HK-2細胞EMT過程中的可能作用機制。
　　結果：
　　1、在白蛋白作用下HK-2細胞KIM-1表達明顯增強，不同濃度白蛋白和不同處理時間KIM-1表達程度相同。
　　2、白蛋白作用于HK-2細胞后KIM-1表達明顯增加，細胞凋亡明顯增加，Bax表達增加，bcl-2表達下降，同時氧化應激反應也增強。給予KIM-1敲除后能夠明顯減輕HK-2細胞凋亡，減輕氧化應激反應。
　　3、白蛋白作用于HK-2細

7、胞，光鏡下觀察細胞形態(tài)學發(fā)生明顯改變。Westernblotting檢測顯示白蛋白導致HK-2細胞α-SMA表達增強，E-cadherin表達減弱，提示HK-2細胞發(fā)生EMT。而KIM-1過表達使上述改變更加明顯。另外發(fā)現(xiàn)在白蛋白導致HK-2細胞EMT過程中p38MAPK磷酸化明顯，而KIM-1的過表達能夠進一步促進p38MAPK的磷酸化。
　　結論：
　　1、白蛋白導致HK-2細胞KIM-1表達明顯增加。
　　2、K