高保真DNA聚合酶分子開(kāi)關(guān)用于TP53基因熱點(diǎn)突變的檢測(cè).pdf

1、目的：利用硫化修飾的堿基特異性引物偶聯(lián)高保真酶所構(gòu)成的突變敏感性分子“開(kāi)/關(guān)”系統(tǒng)檢測(cè)TP53基因的熱點(diǎn)突變（G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T）。同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)擴(kuò)增曲線和熔解曲線準(zhǔn)確、快速地判斷6個(gè)熱點(diǎn)突變的存在與否，并對(duì)突變進(jìn)行半定量分析。
　　方法：將包含上述六個(gè)密碼子的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)LB/Amp/IPTG/X-g

2、al平板篩選出白色克隆，利用載體通用引物和PCR引物對(duì)其進(jìn)行菌液PCR初步鑒定，并通過(guò)測(cè)序分析進(jìn)行確證，得到TP53基因的野生模板質(zhì)粒。采用重疊延伸PCR技術(shù)，對(duì)所需位置的堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變，分別得到6種突變基因型PCR產(chǎn)物，克隆并用同樣方法篩選出陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序確證得到分別含有TP53基因G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T的突變質(zhì)粒模板。然后以這六個(gè)突變位點(diǎn)為檢測(cè)靶點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)3’末端與野生型基因位點(diǎn)

3、或突變型基因位點(diǎn)配對(duì)的硫化修飾引物；利用高保真DNA聚合酶接到突變敏感性分子開(kāi)關(guān)，對(duì)TP53基因野生型質(zhì)粒模板和6種突變型質(zhì)粒模板進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析；采集正常人以及腫瘤患者的組織或血樣標(biāo)本，通過(guò)臨床樣本對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行TP53基因6個(gè)熱點(diǎn)突變的篩查。結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，評(píng)估高保真酶介導(dǎo)的敏感性分子開(kāi)關(guān)在熒光定量PCR中的敏感性和相關(guān)性。
　　結(jié)果：通過(guò)在不同的反應(yīng)體系中分別對(duì)六個(gè)熱點(diǎn)突變進(jìn)

4、行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的PCR反應(yīng)體系中，僅完全配對(duì)引物得以延伸，不完全配對(duì)引物則不被延伸，即3’端硫化修飾突變檢測(cè)引物僅對(duì)配對(duì)的突變模板有擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)野生模板無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。運(yùn)用該檢測(cè)方法對(duì)20例臨床健康志愿者和29例癌癥患者的組織及血樣做檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)TP53基因的G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T突變，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。由此可以看出，突變敏感分子開(kāi)關(guān)對(duì)體細(xì)胞突變的檢測(cè)具有很好

5、的特異性及敏感性。
　　結(jié)論：本研究充分利用高保真DNA聚合酶偶聯(lián)硫化引物構(gòu)成的突變敏感性分子開(kāi)關(guān)成功開(kāi)發(fā)出了可準(zhǔn)確檢出TP53基因175，245，248，249，273和282號(hào)密碼子單堿基突變的新方法，并通過(guò)對(duì)不同類型的臨床標(biāo)本的檢測(cè)，驗(yàn)證了其高敏感性和高效性。該技術(shù)除可用于檢測(cè)血液基因組DNA的遺傳性突變外，還可以檢測(cè)血中游離DNA中存在的微量體細(xì)胞基因突變。該技術(shù)在TP53基因篩查中具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值，能夠?qū)猩鲜鯰