嗜酸氧化亞鐵硫桿菌啟動(dòng)子探針載體的構(gòu)建及petⅡ啟動(dòng)子的分離鑒定.pdf

1、啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要元件。啟動(dòng)子的克隆對(duì)于構(gòu)建基于工程載體，表達(dá)目的蛋白有著重要的意義。本論文中，為了研究原核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能。以pSV-β-galactosidase質(zhì)粒為骨架，通過定點(diǎn)突變的方法引入一個(gè)新的BstBI單酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了能在大腸桿菌（Escherichia coli）中正常復(fù)制及表達(dá)的pSVB啟動(dòng)子探針載體。 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus

2、ferrooxidans）中由cycA2，sdrA2，petA282C2等基因組成的petⅡ操縱子編碼一個(gè)電子傳遞bcl復(fù)合體，位于cycA2基因編碼區(qū)上游序列具有啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特征。本文利用PCR的方法將A.ferrooxidans菌cycA2基因上游DNA片段克隆至pSVB啟動(dòng)子探針載體β-半乳糖苷酶基因上游，替代其原有的啟動(dòng)子（gpt啟動(dòng)子），得到重組質(zhì)粒pAP2。將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌（Escherichia coli）進(jìn)行表達(dá)，通過檢

3、測(cè)β-半乳糖苷酶活性，來鑒定啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱。酶活性分析表明，A. ferrooxidans菌cycA2基因上游DNA片段具有顯著的啟動(dòng)子活性，同時(shí)也說明此啟動(dòng)子探針載體可以用于克隆并鑒定源自A.ferrooxidans菌的重要功能基因的潛在啟動(dòng)子區(qū)。 進(jìn)一步對(duì)petⅡ啟動(dòng)子區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)，在其cycA2基因編碼區(qū)上游-95bp～-90bp處（序列為“TTGATA”）和-59bp～-54bp（序列為“TATGCT”）處存在兩個(gè)符合