粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子在巴斯德畢赤酵母中的表達研究.pdf

1、目的：通過具有創(chuàng)新性的基因工程手段獲得粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，并將其按照酵母偏愛密碼子優(yōu)化，消除自然序列中存在的發(fā)夾結構，然后導入巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，使其誘導表達，獲得具有生物活性且具有一定經濟價值的GM-CSF。 方法：首先從人體基因組克隆得到hGM-CSF全基因，然后通過采用引物5'端加長法克隆了含127個編碼氨基酸的hGM-CSF，在引物克隆過程中對該基因做了局部的密碼子優(yōu)化。最后通過高保真T

2、aq酶擴增和EcoRI單酶切的方法將該基因整合進畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，通過電擊轉化和甲醇誘導篩選，最終獲得一株搖瓶水平粗蛋白表達量達3.89g/l的轉化子。 結果：PCR、SDS-PAGE與westeran blotting免疫雜交證實hGM-CSF活性正常。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)所表達的hGM-CSF均發(fā)生了糖基化，通過N-糖苷酶F去糖基化也證實了這點。 結論：本研究成功構建了可高效表達、有效分泌hGM