中國肝癌病人中四種p53突變體細胞功能的研究.pdf

1、肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界最高發(fā)的惡性腫瘤之一。在我國，肝癌的死亡率居第2位，僅次于肺癌。腫瘤抑制基因p53是研究最為廣泛的基因之一，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關。50％以上的腫瘤中都存在有p53基因的突變。p53是細胞應激的關鍵性調控因子之一，在發(fā)生細胞應急或受損傷的情況時，p53能整合各種不同的細胞危急事件信號，通過轉錄或非轉錄途徑對這些信號作出包括細胞生長抑制或凋亡在內的不同反應，以阻止遺

2、傳信息遭受破壞的細胞進入細胞周期，阻止細胞惡性轉化，監(jiān)視細胞基因組的完整性。因此該基因的突變及失活成為腫瘤研究領域的熱點。 前期研究采用PCR擴增產(chǎn)物直接測序的方法，對202例中國肝癌病人的病理組織標本進行p53基因的全程突變檢測。在p53基因編碼區(qū)的11個外顯子中，檢測出涉及氨基酸改變的25種核苷酸突變。將檢測結果與已經(jīng)報道的中國肝癌中p53基因突變進行比較，本實驗所篩查到的25種突變中僅有2種R249S(AGG-AGT，A

3、GG-AGC)和V157F曾經(jīng)被報道過，其余的22種尚無報道。為探討p53突變與肝癌發(fā)生的關系，本研究根據(jù)所篩查到的突變，對在中國肝癌病人中未曾報道過的4種p53突變體C141Y、R156P、C176F、P191S進行細胞功能方面的研究。本研究中，4種突變體的突變率均為0.459％。 首先從人肝cDNA文庫中克隆了野生型p53基因，利用定點突變的方法構建了4種真核表達載體pCMV-C141Y、pCMV-R156P、pCMV-C

4、176F、pCMV-P191S，轉染p53缺陷型的H1299細胞系。Western Blot檢測表明，四種p53突變體在轉染量相等的情況下，蛋白表達量相當。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對四種突變體的轉錄活性研究結果表明：同野生型p53相比，C141Y、R156P、C176F對報告質粒pP53-TA-Luc和p21啟動子的轉錄激活能力顯著下降，幾乎喪失轉錄激活作用，而P191S對報告質粒pP53-TA-Lue的轉錄激活能力與同野生型p53相

5、當，對p21啟動子的轉錄激活能力比野生型p53顯著增強，相對熒光強度約為野生型p53的2.5倍；流式細胞儀對四種突變體的凋亡檢測結果表明：突變體C141Y、R156P、C176的促凋亡能力顯著降低，突變體C141Y、R156P的凋亡細胞比例僅相當于野生型p53的1/3，突變體C176F凋亡細胞比例相當于野生型p53的2/3，突變體P191S的促凋亡能力與同野生型p53相當。 本研究表明，4種p53突變體功能差異可能是由于突變本

6、身所致，而不是由于在細胞中蛋白表達水平的差異所引起的。有些突變會使p53作為轉錄因子的功能喪失，促凋亡能力下降如C141Y、R156P、C176F，而P191S突變對p53的轉錄活性和促凋亡能力沒有顯著影響。說明p53突變與腫瘤發(fā)生之間的關系除了與突變型p53轉錄活性及促凋亡能力下降有關外，還存在獨立于上述功能的其它模式。本研究首次大規(guī)模的對202例中國肝癌病人病理組織標本的p53基因進行全程突變檢測，所檢測的結果為世界范圍內p53基因