靜態(tài)注射化學發(fā)光法測定氧化酶活性的研究及應用.pdf

1、目的:氧化酶是一類催化底物氧化生成過氧化氫的酶,包括葡萄糖氧化酶和脂酰輔酶A氧化酶等,可通過檢測其單位時間內(nèi)H2O2的生成量測得其活性。因此,可利用分析速度快、儀器設(shè)備簡單、靈敏度高、線性范圍寬的化學發(fā)光法測定H2O2含量,反映氧化酶的活性。但目前,大多采用流動注射化學發(fā)光法,試劑消耗量較大,限制了此方法在小樣品酶活性測定中的應用。因靜態(tài)注射化學發(fā)光分析法,除了有前面提到的化學發(fā)光法的特點外,又有試劑用量小的優(yōu)點,所以,本實驗擬建立靜態(tài)

2、注射化學發(fā)光分析法,用于測定樣品量較小、活性較低的氧化酶樣本。
　　 水溶性好、光量子效率高的魯米諾是常用的化學發(fā)光試劑。已有使用對碘苯酚增強的魯米諾.過氧化氫.辣根過氧化物酶化學發(fā)光體系,測定痕量的辣根過氧化物酶的報道。
　　 基于以上原因,本文將對碘苯酚增強的魯米諾-過氧化氫-辣根過氧化物酶化學發(fā)光體系與氧化酶反應偶聯(lián),用靜態(tài)注射法測定酶促反應中H2O2的生成量,建立測定葡萄糖氧化酶活性和脂酰輔酶A氧化酶活性的新方法

3、。并分別用于蜂蜜中葡萄糖氧化酶活性的測定,以及正常、2型糖尿病、單純胰島素抵抗的大鼠肝臟、心肌、腦組織的脂酰輔酶A氧化酶活性的測定。
　　 方法:采用兩步法測定氧化酶的活性,即酶促反應和化學發(fā)光反應。
　　 第一部分:葡萄糖氧化酶活性測定。
　　 第一步:葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化,產(chǎn)生H2O2。
　　 向反應容器中加入20μl反應體系(含葡萄糖,0.1 mol/L,磷酸鉀緩沖液),加入10μl待測酶活性

4、的樣品溶液啟動反應并計時。反應在35℃下進行。
　　 第二步:經(jīng)魯米諾化學發(fā)光反應,測定第一步中生成的H2O2量
　　 上述酶促反應一定時間后,立即將反應容器轉(zhuǎn)移至IFFS-A型多功能化學發(fā)光檢測器的閉光樣品室內(nèi),用注射器取魯米諾發(fā)光液400μl(含Luminol,HRP,PIP,磷酸鉀緩沖液)從靜態(tài)注射接口注入,終止葡萄糖氧化酶催化反應的同時啟動發(fā)光反應(40℃下進行),在光電倍增管負高壓400V的條件下,記錄化學發(fā)光

5、響應信號,以其峰高為相對發(fā)光強度。根據(jù)H2O2標準曲線求出化學發(fā)光強度值對應的H2O2量,繼而求出葡萄糖氧化酶的活性。葡萄糖氧化酶活性定義為35℃下,1分鐘內(nèi)催化葡萄糖氧化產(chǎn)生1μmole H2O2所需的酶量為1個單位(U)。
　　 第二部分:脂酰輔酶A氧化酶活性測定
　　 第一步:脂酰CoA氧化酶氧化軟脂酰CoA,生成H2O2
　　 于反應容器中加入20μ l反應體系(含軟脂酰CoA,FAD,200μmol/L

6、NAD,170μ mol/L CoA,4mmol/LNAN3,5mmol/L EDTANa3,0.1mol/L磷酸鉀緩沖液,pH8.5),加入10μl待測酶活性的樣品溶液啟動反應并計時。反應在35℃下進行。
　　 第二步:經(jīng)魯米諾化學發(fā)光反應,測定第一步中生成的H2O2量
　　 上述酶促反應一定時間后,參照葡萄糖氧化酶活性測定中詳述的方法,使用魯米諾發(fā)光液測定H2O2并計算其濃度,繼而可求出脂酰輔酶A氧化酶的活性。脂酰輔

7、酶A氧化酶活性定義為,在本實驗條件下,每分鐘生成1μ mol H2O2所需的酶蛋白量為1個活性單位(U)。
　　 結(jié)果:
　　 1葡萄糖氧化酶活性測定條件的優(yōu)化
　　 1.1葡萄糖氧化酶反應:在0.1mol/L,pH5.5磷酸鉀緩沖液,0.2mol/L葡萄糖的反應體系中,35℃下,反應60min。
　　 1.2魯米諾化學發(fā)光反應:在0.1mol/L,pH8.5磷酸鉀緩沖液,40μmol/L魯米諾,50μg

8、/ml辣根過氧化物酶,20μmol/L對碘苯酚的體系中,40℃下反應。
　　 所建的葡萄糖氧化酶靜態(tài)注射-化學發(fā)光法,其線性范圍為1.67×104-3.0×10-3U/ml。所測樣本的相對標準偏差為5.24％。
　　 2脂酰輔酶A氧化酶活性測定條件的優(yōu)化
　　 2.1脂酰輔酶A氧化酶反應:在0.1mol/L pH8.5磷酸鉀緩沖液30μmol/L,軟脂酰輔酶A,101μmol/L FAD,200μmol/L NA

9、D,170μmol/L輔酶A,4mmol/L NaN3,5mmol/LEDTANa3的反應體系中,40℃下,反應10min。
　　 2.2魯米諾化學發(fā)光反應:條件同上
　　 所建的脂酰輔酶A氧化酶靜態(tài)注射-化學發(fā)光法,所測樣本的相對標準偏差為7.62％。
　　 3樣本測定結(jié)果
　　 3.1蜂蜜葡萄糖氧化酶的測定結(jié)果:蜂蜜放置一年,其葡萄糖氧化酶的活性為5.379U/mg。
　　 3.2大鼠組織中脂

10、酰輔酶A氧化酶的活性
　　 3.2.1肝組織脂酰輔酶A氧化酶活性測定結(jié)果:對照組為65.57±9.16mU/mg,單純胰島素抵抗組為60.75±10.15 mU/mg,糖尿病組為78.33±12.18 mU/mg。糖尿病組與對照組相比,脂酰輔酶A氧化酶活性有所增加(P＜0.05),單純胰島素抵抗組與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3.2.2心肌組織脂酰輔酶A氧化酶活性測定結(jié)果:對照組脂酰輔酶A氧化酶

11、活性為31.81±5.54 mU/mg,單純胰島素抵抗組為30.69±3.74 mU/mg,糖尿病組為37.82±6.69 mU/mg。糖尿病組與對照組相比,脂酰輔酶A氧化酶活性有所增加(P＜0.05),單純胰島素抵抗組與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3.2.3大鼠腦組織脂酰輔酶A氧化酶活性測定結(jié)果:對照組脂酰輔酶A氧化酶活性為19.86±4.40 mU/mg,單純胰島素抵抗組為15.74±2.90mU/

12、mg,糖尿病組為14.51±2.80 mU/mg。與對照組相比,單純胰島素抵抗組(P＜0.05)和糖尿病組(P＜0.01)的脂酰輔酶A氧化酶活性均有下降單純胰島素抵抗組。
　　 結(jié)論:
　　 1化學發(fā)光法測定葡萄糖氧化酶活性和脂酰輔酶A氧化酶活性,方法簡便快捷、靈敏度高,可用于測定低酶活、小樣品量的樣品。該法應用于蜂蜜中葡萄糖氧化酶活性的測定及大鼠肝臟、心肌及腦組織中脂酰輔酶A氧化酶活性的測定中,結(jié)果滿意。