中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1的表達研究.pdf

1、第一章中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1和甲殼動物結構基因的研究現(xiàn)狀中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1系馬長艷于2003年利用差減雜交技術獲得的中華絨螯蟹Ⅲ期卵巢的高表達基因，該基因cDNA序列全長876 bp、編碼252個氨基酸，編碼蛋白質分子量大小28.18 kDa。 結構基因指決定某種多肽鏈(蛋白質)或酶分子結構的基因。本章重點敘述甲殼動物結構基因近10年的研究進展。 中華絨螯蟹卵巢是中華絨螯蟹的雌性性腺，本章敘述了近年來中

2、華絨螯蟹卵巢在生理學、組織學和分子生物學方面的研究。 第二章中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1在大腸桿菌(Escherichia coli)BL2l(DE3) 中的表達以有EJO1基因cDNA的pMD18-T載體為模板，利用ex3591、ex3592引物進行擴增得到帶BamH I和Xho I識別位點的EJO1開放閱讀框，PCR產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接并進行BamH I和Xho I雙酶切，目的片段經(jīng)切膠純化回收。將回收的EJO1基因

3、片段插入用BamH I和Xho I雙酶切的pET28b載體中，構建成表達質粒pET28b-EJO1。將構建好的原核表達質粒pET28b-EJO1轉化大腸桿菌BL2l(DE3)，用終濃度為0.1 mm01/L的IPTG誘導融合蛋白表達，并于各不同時間點收集菌液，進行SDS-PAGE蛋白凝膠分析。結果表明，在(Mr)略大于30 kDa處有特異蛋白條帶，其中誘導6小時的表達量最大，表達產(chǎn)物分子量與推算的融合蛋白分子量(32 kDa)相符，故初

4、步判定為目的蛋白。經(jīng)過鎳離子柱親和層析進一步純化得到純度較高的EJO1-HIS<,6>(PRO)融合蛋白。 第三章中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1在畢氏酵母(Pichia pastoris)中的表達 以有EJO1基因cDNA的pMDl8-T載體為模板，利用eukl、euk2引物進行擴增，獲得帶Xho I和EcoR I識別位點的EJO1開放閱讀框，PCR產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接并進行Xho I和EcoR I雙酶切，目的

5、片段經(jīng)切膠純化回收。將回收的EJ01基因片段插入用Xho I和EcorI雙酶切的pPIC9載體中，構建成表達質粒pPIC9-EJO1。將構建好的真核表達質粒pPIC9-EJO1進行Bgl II酶切線性化，經(jīng)切膠純化后電轉化酵母細胞GSll5，篩選的陽性克隆經(jīng)甲醇誘導融合蛋白表達并進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析。結果表明，在(Mr)略大于30 kDa處有特異蛋白條帶，與推算的融合蛋白分子量32 kDa相符，故初步判定為目的蛋白EJO