大黃素通過ILK通路調(diào)控上皮性卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲及其機(jī)制的實驗研究.pdf

1、研究背景:上皮性卵巢癌(EOC)是死亡率最高的婦科惡性腫瘤。由于卵巢癌早期癥狀不典型并且缺乏有效的早期檢測指標(biāo)導(dǎo)致多數(shù)患者確診時已為疾病的晚期并伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雖然廣泛轉(zhuǎn)移卵巢癌的主要致死原因，但是發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在的分子機(jī)制還沒有完全闡明。最近的研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與卵巢癌發(fā)生轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系。
　　整合素連接激酶(ILK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。它最初是因為與β1和β3整合素亞單位結(jié)合被發(fā)現(xiàn)的。整合素連接酶在通過整合

2、素通路來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖，遷移上發(fā)揮著重要的作用。ILK一旦被激活，直接使得包括糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和蛋白激酶B(PKB/Akt)在內(nèi)的多個重要的信號分子磷酸化進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖，周期，粘附及細(xì)胞外基質(zhì)。ILK的表達(dá)水平在多種人類惡性腫瘤中都是上調(diào)的并且與腫瘤的分期和分級具有相關(guān)性。此外，有研究證明ILK可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的EMT過程來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。大黃素（1，3，8-三羥基-6甲基蒽醌）是一種是從大黃，

3、蘆薈等植物的根莖中提取出來的蒽醌類的衍生物。已知大黃素對腫瘤細(xì)胞的增殖，腫瘤的發(fā)生，血管再生及腫瘤轉(zhuǎn)移具有抑制作用。最近的研究表明，大黃素可以通過WNT/β-catenin通路抑制多種腫瘤細(xì)胞的EMT。同時，之前的研究也證實大黃素通過調(diào)節(jié)ILK通路促進(jìn)人類子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)，從而抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲的能力。
　　目的:本研究旨在探討大黃素是否能通過抑制EMT來抑制EOC細(xì)胞遷移和侵襲并探索在細(xì)胞及

4、裸鼠移植瘤內(nèi)的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.用CCK-8法檢測不同濃度大黃素分別作用24小時，48小時和72小時對卵巢癌細(xì)胞系（A2780和SK-OV-3）增殖的影響。
　　2.Transwell遷移和侵襲實驗用來檢測A2780和SK-OV-3細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　3.Western-blot和免疫組化(IHC)檢測EOC細(xì)胞和移植瘤中上皮表型分子(E-cadherin和Claudin)，間質(zhì)表型分子(N

5、-cadherin和Vimentin)以及ILK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　4.小干擾RNA(SiRNA)-ILK和SiRNA-Slug分別用來敲除A2780細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞中ILK和Slug的表達(dá)。ILK慢病毒(pLVX-C1-ILK)用來建立ILK穩(wěn)定過表達(dá)EOC細(xì)胞系。
　　結(jié)果:
　　1.大黃素對EOC細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力的影響大黃素對SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞具有抑制其增殖作用且呈濃

6、度和時間依賴性。大黃素作用48小時后，SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞的遷移和侵襲能力都明顯減弱。
　　2.大黃素對EOC細(xì)胞中EMT相關(guān)分子及Slug表達(dá)水平的影響Western-blot結(jié)果表明在大黃素的作用下SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞上皮表型分子（E-cadherin和Claudin）的表達(dá)上調(diào)而間質(zhì)表型分子(N-cadherin和Vimentin)和轉(zhuǎn)錄因子(Slug)的表達(dá)下調(diào)，且呈濃度依賴性。轉(zhuǎn)染siRNA-

7、Slug到SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞中，N-cadherin和Slug的表達(dá)降低而E-cadherin的表達(dá)增高。siRNA-Slug轉(zhuǎn)染后再加入emodin組的SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞的遷移和侵襲能力最弱。
　　3.大黃素對EOC細(xì)胞中ILK信號通路相關(guān)分子表達(dá)的影響SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞在大黃素作用48小時后ILK，p-GSK-3β，β-catenin和Slug的表達(dá)減少并呈濃度依賴性。
　

8、　4.大黃素通過調(diào)控ILK抑制EOC細(xì)胞發(fā)生EMT的驗證siRNA-ILK轉(zhuǎn)染后，SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞ILK，p-GSK-3β，β-catenin和Slug的表達(dá)與對照組相比也降低。同時，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)而N-cadherin的表達(dá)下調(diào)。并且siRNA-ILK轉(zhuǎn)染后加用大黃素組與單獨大黃素組或單獨siRNA-ILK轉(zhuǎn)染組相比ILK，p-GSK-3β，β-catenin，Slug和N-cadherin的表達(dá)更低

9、，E-cadherin的表達(dá)更高。
　　5.大黃素通過調(diào)節(jié)ILK/GSK-3β通路抑制EOC細(xì)胞的EMT的驗證SB216763（GSK-3β抑制劑）處理后除ILK的表達(dá)沒有顯著變化外，p-GSK-3β，β-catenin和Slug的表達(dá)均明顯增強(qiáng)。同時，E-cadherin的表達(dá)量減少而N-cadherin的表達(dá)量增加。所以，大黃素可以逆轉(zhuǎn)SB216763對SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞的作用。
　　6.大黃素對ILK過

10、表達(dá)后SK-OV-3和A2780細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響過表達(dá)ILK可以增強(qiáng)A2780和SK-OV-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。大黃素(20μM)可以抑制ILK過表達(dá)引起的EOC細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)且大黃素可以抑制ILK過表達(dá)所導(dǎo)致的E-cadherin，Vimentin，MMP-9和Slug表達(dá)水平的變化。
　　7.大黃素對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長速度的影響pLVX-ILK組裸鼠的移植瘤體積增長與pLVX-Con組裸鼠相比明顯迅速，但p

11、LVX-ILK+emodin裸鼠組與pLVX-ILK+溶劑組裸鼠相比體積增長顯著減慢。
　　8.大黃素對裸鼠移植瘤中EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響pLVX-ILK+溶劑組與對照組相比移植瘤中E-cadherin表達(dá)下降;ILK，Slug，MMP-9和Vimentin的表達(dá)水平升高。而pLVX-Con+emodin組與對照組相比E-cadherin表達(dá)水平升高;ILK，Slug，MMP-9和Vimentin的表達(dá)水平降低。
　　9.

12、大黃素對裸鼠肝腎及心功能的影響腹腔注射大黃素(50mg/kg)對裸鼠肝腎及心臟沒有明顯的毒性作用。
　　結(jié)論:
　　1.大黃素可以抑制SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力。
　　2.大黃素通過調(diào)節(jié)ILK/GSK-3β/Slug信號通路抑制發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)而抑制SK-OV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　3.大黃素可以抑制裸鼠卵巢癌移植瘤的生長及轉(zhuǎn)移。
　　4.大