CMTM3在食管鱗癌中的表達及其對預(yù)后影響的相關(guān)研究.pdf

1、前言:
　　在世界范圍內(nèi)，食管癌是所有人類惡性腫瘤中惡性程度最高的腫瘤之一，在人類高發(fā)腫瘤死亡率的排名中處于第六位。在所有食管癌的分型中，食管鱗癌的發(fā)生率超過百分之九十。食管鱗癌是一種起源于食管上皮細胞的惡性程度很高的腫瘤，它的發(fā)生率在全球范圍內(nèi)是非常高的，特別是在中國。盡管目前對于食管癌的診斷和治療的方法已經(jīng)照比從前改善很多，但是對于大多數(shù)食管癌患者來講還是存在著發(fā)現(xiàn)即是晚期的尷尬局面，這也就意味著他們失去了手術(shù)根治的機會。因此

2、，研究食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展途徑，尋找有關(guān)其早期診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后判斷的新指標(biāo)和可靠的、特異性高的食管癌治療靶點，提高食管癌患者生存率和降低死亡率，是目前食管癌研究中至關(guān)重要的課題。
　　Human chemokine-like factor(CKLF)-like MARVEL transmembrane domain-containing family(CMTM)為CKLF樣MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域超家族，是由我國北京大學(xué)的人類疾病

3、基因研究中心首次發(fā)現(xiàn)并報道的一個新基因家族。在人類中，CMTM家族包括9個成員，即CKLF和CMTM1-8。目前研究表明，CKLF樣MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域超家族蛋白在人類的免疫系統(tǒng)、男性的生殖系統(tǒng)、和致腫瘤因素中起到非常重要的作用。CMTM3是CMTM家族中的一員，其分子結(jié)構(gòu)介于經(jīng)典的趨化因子和四次跨膜蛋白超家族之間。在四次跨膜蛋白超家族(transmem-brane4 super family，TM4SF)中，存在著許多成員與腫瘤的發(fā)

4、生相關(guān)，如TM4SF中的Plasmolipin、MAL與BENE蛋白，而且他們在前列腺癌和食管癌中都展現(xiàn)了很強的腫瘤抑制作用。CMTM3位于染色體16q22.11，目前有研究表明其在很多惡性腫瘤中都存在表達缺失，如前列腺癌和口腔鱗狀細胞癌和睪丸癌中都存在低表達的情況。所以基于目前的研究，在惡性腫瘤中，CMTM3很可能扮演著腫瘤抑制基因的角色。然而在食管癌中，其表達對食管癌預(yù)后影響和臨床特征之間的關(guān)系還不甚了解，值得我們進行探究。

5、　　目的:
　　本研究旨在探討CMTM3在食管鱗癌組織和食管鱗癌細胞株中的表達情況以及與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展與臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，為其在臨床治療中提供新的思路及依據(jù)。研究的第一部分我們利用免疫組化實驗，檢測CMTM3在食管鱗癌組織中的表達，分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及對患者預(yù)后的影響;在研究的第二部分中，我們通過實時定量PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)來檢測20組成對食管癌和癌旁組織在mRNA和蛋白水平中CMTM3的

6、表達情況，分析其表達差異;研究的第三部分，通過對食管鱗癌細胞株KYSE-50中CMTM3的過表達，運用MTT和Transwell技術(shù)來觀察其對食管鱗癌增殖、侵襲能力的影響，揭示CMTM3與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討CMTM3潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　方法:
　　1、實驗對象
　　本次試驗中用于免疫組化研究的組織包括110例石蠟包埋的食管鱗癌組織和36例食管鱗癌癌旁組織，它們都來自于2008年5月到2010年

7、4月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療的患者，并且術(shù)前沒有經(jīng)歷過化療。20對食管鱗癌及其癌旁組織的新鮮組織標(biāo)本取自于2014年4月到2014年8月之間在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進行手術(shù)的部分食管鱗癌患者。此外還包含1個正常食管鱗癌細胞株HEEC和2個食管鱗癌細胞株KYSE-50和KYSE-390。
　　2、實驗方法
　　(1)免疫組織化學(xué)方法:檢測110例食管鱗癌組織及36例食管鱗癌癌旁組織中CMTM3蛋白的表達情況。

8、
　　(2)Western blot方法:檢測CMTM3蛋白在20對食管鱗癌組織及它們相對應(yīng)的癌旁組織中的表達情況。
　　(3)實時定量PCR方法:檢測CMTM3基因在20對食管鱗癌組織及它們相對應(yīng)的癌旁組織中的表達。
　　(4)瞬時轉(zhuǎn)染方法:利用真核質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)食管鱗癌細胞株KYSE-50中CMTM3的表達含量。
　　(5) MTT方法:檢測CMTM3過表達后食管鱗狀細胞癌的細胞增殖能力的變化情況。<

9、br>　　(6) Transwell實驗:檢測CMTM3過表達后食管鱗狀細胞癌的細胞侵襲能力的變化情況。
　　(7)細胞培養(yǎng)技術(shù):對食管鱗癌細胞株常規(guī)培養(yǎng)。
　　結(jié)果
　　1、CMTM3在食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義
　　(1)免疫組化檢測的結(jié)果顯示，在110例食管鱗狀細胞癌組織中，有79例食管鱗癌組織存在CMTM3的低表達，占總數(shù)的71.82％;有31例對CMTM3表現(xiàn)為高表達，占總數(shù)的28.18％。在36

10、例癌旁的組織中，27例組織存在CMTM3的高表達，占總數(shù)的75％。
　　(2)結(jié)合臨床資料進一步研究表明，CMTM3的表達與患者的年齡(P=0.280)、性別(P=0.275)、腫瘤發(fā)生位置(P=0.357)和腫瘤分化程度(P=0.730)無關(guān)，但是結(jié)果顯示其低表達與腫瘤高分期、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.01)。
　　2、CMTM3在新鮮食管癌及癌旁組織的基因和蛋白水平表達情況及在食管鱗癌細胞株中的表達情況
　　

11、(1)我們的檢查發(fā)現(xiàn)，在20對新鮮食管鱗癌及癌旁組織中，有15對癌組織的CMTM3基因的表達低于其所對應(yīng)的癌旁組織，占總數(shù)的75％(15/20，P＜0.05)。
　　(2)同樣，在對成對樣本中的CMTM3蛋白水平含量進行檢測后，我們的結(jié)果顯示，20對新鮮食管鱗癌及癌旁組織中，有15對癌組織的CMTM3蛋白的表達低于其所對應(yīng)的癌旁組織，占總數(shù)的75％(15/20，P＜0.05)。
　　(3)對于細胞中CMTM3蛋白含量的結(jié)果檢

12、測顯示，CMTM3在人正常食管粘膜細胞系HEEC中的表達高于食管鱗癌細胞系KYSE-390和KYSE-50，其中鱗癌細胞系KYSE-50中CMTM3的表達低于KYSE-390。
　　(4)在食管癌和癌旁組織中，CMTM3在基因和蛋白水平上表達都降低。
　　3、CMTM3過表達后對食管鱗癌細胞增殖、侵襲的影響
　　(1)我們的研究結(jié)果顯示，上調(diào)食管鱗癌細胞系KYSE-50中的CMTM3后，其增殖能力得到了顯著的抑制。

13、r>　　(2)在細胞侵襲實驗中，Transwell實驗結(jié)果顯示，過表達CMTM3后的KYSE-50細胞的侵襲能力顯著降低，結(jié)論具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、CMTM3在食管鱗狀細胞癌組織中的表達與腫瘤臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān)，且其表達情況與患者的預(yù)后生存率相關(guān)。
　　2、與癌旁組織相比，CMTM3在食管鱗狀細胞癌組織及食管鱗癌細胞系中均呈低表達。
　　3、過表達CMTM3可使食管鱗癌細胞KYSE-5