IL-8促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞EMT的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討IL-8（interleukin-8）促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，SK-BR-3上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用及其相關(guān)機(jī)制，初步闡明IL-8在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：1.采用蛋白質(zhì)印記法（western blotting, WB）和半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR)檢測人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7，SK-BR-3，

2、MDA-MB-231內(nèi) IL-8受體CXCRA，CXCRB的表達(dá)；采用細(xì)胞因子IL-8處理乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7，SK-BR-3，MDA-MB-231，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；Western blotting檢測IL-8處理后乳腺癌細(xì)胞內(nèi)EMT標(biāo)志蛋白上皮鈣粘蛋白（E-cadherin）,波形蛋白（Vimentin）和纖維連接蛋白（Fibronectin）表達(dá)的變化。
　　2. IL-8處理人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，S

3、K-BR-3后，采用半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ real-time fluorescence quantitative PCR，QRT-PCR）和Western blotting檢測EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail mRNA及蛋白水平的變化。
　　3.采用 IL-8下游主要信號(hào)通路 MAPK/ERK1/2, PI3K/AKT, JAK/STAT3[1]的抑制劑及 IL-8處理

4、乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7，Western blotting檢測信號(hào)通路抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響；采用PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制劑及IL-8處理乳腺癌細(xì)胞株MCF-7， SK-BR-3，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞遷移能力的變化， Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的變化，同時(shí)采用半定量 PCR(semi-quantitative RT-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ real-time fluorescenc

5、e quantitative PCR，QRT-PCR）檢測Snail的mRNA表達(dá)變化，采用Western blotting檢測EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin, Vimentin, Fibronectin及Snail蛋白表達(dá)水平變化。
　　4.采用免疫共沉淀技術(shù)以富集乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3中Snail及與Snail結(jié)合的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE)分離免疫沉淀復(fù)合物,經(jīng)銀染后將膠按大小大致平均切成

6、三份，送北京華大蛋白公司進(jìn)行質(zhì)譜(LC-MSMS)檢測。分析質(zhì)譜結(jié)果以篩選與Snail相互作用的蛋白。NCBI數(shù)據(jù)庫查詢篩選出來的蛋白的功能特點(diǎn)并采用網(wǎng)頁軟件PEPSITE檢測其與Snai相互結(jié)合能力的大小。
　　5.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）檢測良性乳腺增生、原位乳腺癌及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌臨床標(biāo)本中 IL-8, CXCRB, E-cadherin, Vimentin, Snail

7、, C14orf166以及TUBA1B表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　6.建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型，瘤內(nèi)注射IL-8，以驗(yàn)證IL-8對(duì)裸鼠乳腺癌生長、肝肺轉(zhuǎn)移的影響，并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）檢測IL-8對(duì)乳腺癌移植瘤內(nèi)EMT標(biāo)志蛋白、 Snail、C14orf166以及TUBA1B表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：1. Western blotting及半定量 PCR結(jié)果均表明，1型 IL-8

8、受體CXCRA、2型IL-8受體CXCRB在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7均有表達(dá)，而SK-BR-3及MDA-MB-231均只表達(dá)2型IL-8受體CXCRB;光學(xué)顯微鏡下觀察到IL-8可促進(jìn)MCF-7，SK-BR-3細(xì)胞形態(tài)發(fā)生EMT，即細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長，出現(xiàn)偽足，細(xì)胞間粘附性下降而逐漸發(fā)生分離，而MDA-MB-231形態(tài)變化不大；Western blotting結(jié)果表明 IL-8可下調(diào)MCF-7，SK-BR-3細(xì)胞上皮標(biāo)志分子E-cadher

9、in的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志分子 Vimentin及 Fibronectin的表達(dá)，即 IL-8可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，SK-BR-3發(fā)生 EMT，而對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞作用不明顯，后續(xù)試驗(yàn)選擇乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，SK-BR-3作為研究對(duì)象。
　　2.半定量PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果均表明，IL-8能顯著上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的mRNA及蛋白水平。
　　3. We

10、stern blotting結(jié)果表明，IL-8通過PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞 EMT的發(fā)生，即對(duì)乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7間質(zhì)標(biāo)志分子Vimentin表達(dá)上調(diào)的作用，可被 PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑阻斷；劃痕實(shí)驗(yàn)及 Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，IL-8提高乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲的能力，可被PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑阻斷；IL-8上調(diào)Snail， Vimentin, Fibronectin并下調(diào)E-cadherin

11、的作用也可被PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑阻斷。以上結(jié)果均表明IL-8可能是通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)、促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。
　　4.免疫共沉淀蛋白復(fù)合物經(jīng)SDS-PAGE分離、質(zhì)譜定性檢測膠內(nèi)蛋白質(zhì)，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)C14orf166和 TUBA1B是與Snail相互作用的蛋白，且 NCBI數(shù)據(jù)庫查詢到這兩個(gè)蛋白與癌癥侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。網(wǎng)頁軟件PEPSITE檢測到C14orf16

12、6和 TUBA1B與Snail相互結(jié)合能力較強(qiáng)。采用半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR)、Western blotting檢測，結(jié)果表明IL-8可上調(diào)C14orf166和 TUBA1B mRNA及蛋白的表達(dá)，而PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑可阻斷此作用。
　　5.免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）檢測結(jié)果表明良性乳腺增生、原位乳腺癌及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌臨床組織標(biāo)本中

13、IL-8, CXCRB, Vimentin, Snail, C14orf166以及TUBA1B表達(dá)水平依次增高，相反地，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)依次降低。
　　6.裸鼠乳腺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射細(xì)胞因子 IL-8處理移植瘤后，與對(duì)照組相比，腫瘤體積及質(zhì)量明顯增大；小鼠肝、肺組織轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)增多，且經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)，IL-8處理組肝肺轉(zhuǎn)移明顯；移植瘤經(jīng)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測表明， IL-8處理組 Vimentin, Sna

14、il, C14orf166以及TUBA1B表達(dá)明顯增高，而E-cadherin表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論：1. IL-8促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SK-BR-3 EMT的發(fā)生且上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)。
　　2.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)初步表明C14orf166、TUBA1B與Snail相互作用， IL-8可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生、上調(diào)Snail及C14orf166及TUBA1B的表達(dá)