糖尿病大鼠腎組織NF-κB、TGF-β的表達(dá)及瑞格列奈對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(DiabetesMellituse，DM)最常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和纖維化在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。糖尿病時機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，通過產(chǎn)生過多的活性氧簇(ReactiveOxygen Species，ROS)直接損傷機(jī)體蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，還可通過激活多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB（Nuclear Tr

2、anscription FactorκB)，促進(jìn)多種炎癥因子、巨噬細(xì)胞及促腎臟纖維化關(guān)鍵因子TGF-β等的過度表達(dá)，共同導(dǎo)致腎臟病變。如何阻斷或抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，減緩腎臟纖維化成為預(yù)防和治療DN的關(guān)鍵。瑞格列奈(Repaglinide，RE)是一種非磺酰脲類促胰島素分泌劑，是Ⅱ型糖尿病患者臨床一線口服降糖藥物，可有效控制餐后血糖。有研究報道，RE還可減緩DN進(jìn)展，但確切機(jī)制尚不明了。
　　本課題擬通過建立鏈脲佐菌素(Stre

3、ptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的DM大鼠模型，測定大鼠腎臟組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)含量及總抗氧化能力(T-AOC)活性，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、實(shí)時定量熒光PCR(real-timeFQ-PCR)等方法檢測腎組織中NF-κB、TGF-β表達(dá)情況，并予瑞格列奈(Repaglinide，RE)2mg/Kg進(jìn)行干預(yù)，觀察DM大鼠腎臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及纖維化狀況，并探討瑞格列奈對其存在的干預(yù)作用及機(jī)制，為人類糖DN的防治提供理論

4、依據(jù)。
　　方法:選擇健康雄性清潔級SD大鼠36只，體重約200±20g，（購自河北醫(yī)科大學(xué)動物中心），隨機(jī)分為正常對照(NC組，n=12)、糖尿病模型組（DM組，n=12）、糖尿病瑞格列奈干預(yù)組（RT組，n=12）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空腹12小時，糖尿病模型組大鼠一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg)，72h后尾靜脈取血檢測血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++，視為造模成功。NC組一次性腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液。

5、試驗(yàn)期間所有大鼠均自由進(jìn)食水，動物房溫度(20℃～26℃)、濕度(40％～70％)相對恒定。RT組大鼠給予瑞格列奈（RE）2mg/kg，1/日，植物油溶劑灌胃，NC組、DM組每天予等量植物油灌胃。分別于造模成功后8周、12周末，每組任取6只大鼠，測定24h尿蛋白(24 hUP)、血糖、尿素氮、血肌酐。并收集大鼠腎組織標(biāo)本，制備組織切片，行蘇木素-伊紅染色(HE染色)及糖原染色(PAS)，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎臟病理變化;檢測腎組織MDA

6、含量、T-AOC活性，免疫組織化學(xué)及real-time PCR方法檢測TGF-β、NF-κB的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，不滿足正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、一般情況
　　DM組、RT組大鼠腹腔注射STZ后逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿，反應(yīng)遲緩，毛發(fā)失去光澤，體重逐漸下降，其中DM組

7、癥狀較RT組明顯加重，而NC組大鼠飲食正常，反應(yīng)靈敏，生長發(fā)育良好，體重明顯增長。
　　2、生化指標(biāo)
　　2.124小時尿蛋白定量
　　與同期NC組相比，8周末、12周末，DM組、RT組大鼠24小時尿蛋白水平均升高(P＜0.05);與同期DM組相比，RT組大鼠24小時尿蛋白水平降低(P＜0.05)。
　　2.2血糖
　　與同期NC組相比，8周末、12周末，DM組、RT組大鼠血糖水平均明顯升高（P＜0.05）

8、;與同期DM組相比，RT組血糖變化不明顯(P＞0.05)。
　　2.3血肌酐、尿素氮
　　與同期NC組相比，8周末、12周末，DM組、RT組大鼠血肌酐、尿素水平升高（P＜0.01）;與同期DM組相比，RT組血肌酐、尿素氮水平下降（P＜0.05）。
　　3、氧化應(yīng)激指標(biāo)
　　3.1 MDA測定
　　與同期NC組相比，8周末、12周末，DM組、RT組大鼠腎組織MDA水平顯著升高（P＜0.05）;與同期DM組相比

9、，RT組MDA水平均有不同程度的下降(P＜0.05)。
　　3.2 T-AOC測定
　　與同期NC組相比，8周末、12周末，DM組、RT組大鼠腎組織內(nèi)的T-AOC活性顯著降低(P＜0.05);與同期DM組相比，RT組T-AOC活性升高(P＜0.05)。
　　4、腎臟組織變化
　　光鏡顯示，NC組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜染色均勻一致，無系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增多等異常改變。與NC組相比，DM

10、組腎小球體積增大，腎小球系膜基質(zhì)彌漫增多，系膜細(xì)胞增多，基底膜增厚，12周末時病理改變更明顯。RT組腎臟組織結(jié)構(gòu)較DM組得到改善。
　　5、免疫組織化學(xué)檢測
　　與同期NC組相比，8周末、12周末，DM組、RT組NF-κB、TGF-β表達(dá)均增多(P＜0.05);與同期DM組相比，RT組NF-κB、TGF-β表達(dá)水平不同程度下降(P＜0.05)。
　　6、Real-time FQ-PCR檢測
　　與同期NC組相比，

11、8周末、12周末時，DM組、RT組NF-κB mRNA、TGF-βmRNA表達(dá)均增多(P＜0.05);與同期DM組相比，RT組NF-κBmRNA、TGF-βmRNA表達(dá)水平不同程度下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、 DM大鼠腎臟組織MDA表達(dá)增高，T-AOC活性降低，提示處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時NF-κB、TGF-β表達(dá)升高，表明有炎癥反應(yīng)及纖維化機(jī)制參與。
　　2、瑞格列奈可減少DM大鼠蛋白尿的產(chǎn)生、改善腎臟