FLP-frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在玉米中的應(yīng)用及轉(zhuǎn)TsVP抗旱玉米的獲得.pdf

1、干旱和鹽漬已經(jīng)成為限制世界農(nóng)作物增產(chǎn)的主要原因。隨著人口增長(zhǎng)和對(duì)生物質(zhì)能源的迫切需求，增加作物產(chǎn)量已成為當(dāng)務(wù)之急，利用生物技術(shù)培育耐鹽抗旱作物品種具有重要的戰(zhàn)略意義。玉米(Zea mays L.)是世界上重要的糧食、飼料兼能源作物，也是重要的工業(yè)原料。玉米需水較多、對(duì)干旱比較敏感，耐鹽性差，低度鹽堿可使其產(chǎn)量大幅度減少。采用傳統(tǒng)的育種方法因缺乏種質(zhì)資源等因素很難獲得玉米耐鹽抗旱新品種，基因工程的發(fā)展加快了玉米育種工作前進(jìn)的步伐，為培育玉

2、米耐鹽、抗旱新品種開辟了新途徑。目前，玉米耐鹽、抗旱基因工程研究尚處在初級(jí)階段，受到國(guó)內(nèi)外玉米育種工作者的關(guān)注。 隨著轉(zhuǎn)基因作物播種面積的快速增長(zhǎng)，用以篩選轉(zhuǎn)基因植物的選擇標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因、除草劑抗性基因等)的使用引發(fā)了人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物安全性的隱憂，影響了消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受程度，也不利于對(duì)同一個(gè)品種進(jìn)行多次轉(zhuǎn)基因操作。因此，培育無選擇標(biāo)記基因或具有安全選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物倍受重視。來自于啤酒酵母2μm質(zhì)粒的F

3、LP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)中重組酶FLP可催化位于同一分子上兩個(gè)同向frt位點(diǎn)間DNA片段的切除，利用該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選完成后選擇標(biāo)記基因的刪除。 基于對(duì)上述問題的考慮，本研究開展了采用FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因玉米中選擇標(biāo)記基因的工作，對(duì)其刪除效率進(jìn)行了分析，并對(duì)提高刪除效率的策略進(jìn)行了探討。本工作不僅培育出了耐鹽抗旱的無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因優(yōu)良玉米新材料，而且為批量獲得無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因玉米提

4、供了成套技術(shù)。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 適合于單子葉植物的FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用本工作通過多輪DNA重組實(shí)驗(yàn)構(gòu)建出適合單子葉轉(zhuǎn)基因植物去除選擇標(biāo)記基因的定點(diǎn)重組系統(tǒng)，包括適合于單子葉植物的FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)和熱誘導(dǎo)型FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。本工作中，為了提高在轉(zhuǎn)基因植物中的重組效率，在FLP重組酶基因編碼區(qū)起始密碼子ATG前添加了植物最適翻譯修飾序列AACA；在含有frt位點(diǎn)的

5、植物表達(dá)載體中位于選擇標(biāo)記基因als兩側(cè)的frt位點(diǎn)，一個(gè)是全長(zhǎng)序列，另一個(gè)為僅包含核心重組序列的截短的frt位點(diǎn)(frtm)。在構(gòu)建適合于單子葉植物的FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)時(shí)，分別以水稻Actinl啟動(dòng)子啟動(dòng)AtNHX1基因、以玉米泛素ubiquintin基因啟動(dòng)子Ubi啟動(dòng)TsVP和FLP基因的轉(zhuǎn)錄，以期轉(zhuǎn)基因能在玉米中高效表達(dá)。為了提高選擇標(biāo)記基因的刪除效率，使FLP重組酶能夠在玉米植株中于特定時(shí)期發(fā)揮作用，減少重組酶的

6、過量及長(zhǎng)期表達(dá)對(duì)植株的傷害，我們又構(gòu)建了熱誘導(dǎo)型FLE/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，F(xiàn)LP重組酶基因由熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子hsp啟動(dòng)，使其在熱激條件下能夠特異表達(dá)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了分別轉(zhuǎn)FLP重組酶基因、AtNHX1及als基因、TsVP及als基因的轉(zhuǎn)基因植株，通過連續(xù)自交得到了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合系。利用這些轉(zhuǎn)基因純合系進(jìn)行選擇標(biāo)記基因刪除實(shí)驗(yàn)。在有性雜交去除選擇標(biāo)記基因途徑中，檢測(cè)到選擇標(biāo)記基因的刪除頻率為40.35％，其中以

7、攜帶FLP重組酶基因的植株為母本進(jìn)行有性雜交得到的F1植株中選擇標(biāo)記被刪除的頻率略高于以其作為父本的，而且als基因被刪除的結(jié)果可以穩(wěn)定遺傳到后代。對(duì)F1植株中FLP重組酶的穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)F1植株與帶有frt位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植株雜交后，子代植株中的重組酶基因FLP仍然可以發(fā)揮功能，作用于frt位點(diǎn)介導(dǎo)重組事件的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入兩對(duì)frt位點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因時(shí)，只在20％左右的植株中檢測(cè)到選擇標(biāo)記基因被完全刪除，即選擇標(biāo)記基因被完全刪除的

8、頻率大幅度降低。 分別以轉(zhuǎn)AtNHX1及als基因的植株和轉(zhuǎn)hap啟動(dòng)的FLP重組酶基因的植株為父、母本進(jìn)行有性雜交，然后通過原位果穗熱激和未成熟胚離體培養(yǎng)熱激兩種方式誘發(fā)選擇標(biāo)記基因的刪除并進(jìn)行刪除頻率的比較。前一方式是在授粉后不同時(shí)間進(jìn)行熱激處理，以授粉后24h在42℃下熱激1h時(shí)誘發(fā)的刪除頻率最高，去除選擇標(biāo)記基因的種子達(dá)60.36％。后一方式是將未成熟胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后在不同時(shí)間進(jìn)行熱激處理，以離體培養(yǎng)24h

9、時(shí)熱激(42℃)1h的去選擇標(biāo)記基因的頻率最高，達(dá)到50％。 同已報(bào)道工作相比較，本工作為提高單子葉轉(zhuǎn)基因植物生物安全性提供了有競(jìng)爭(zhēng)力的技術(shù)體系。 去除選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)AtNHX1基因玉米的耐鹽性分析擬南芥液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AtNHX1)在擬南芥耐鹽中起有重要作用。本工作將AtNHX1基因?qū)氲接衩字仓曛?，以FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)去除選擇標(biāo)記基因als，得到了耐鹽性明顯提高而無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因

10、玉米。Southern雜交表明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中并在后代穩(wěn)定遺傳。RT-PCR結(jié)果表明外源基因在玉米中能夠穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)AtNHX1基因玉米，無論是在鹽脅迫處理前還是在鹽脅迫處理過程中，轉(zhuǎn)基因植株均具有比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓觑@著提高的液泡膜Na+/H+交換活性，而且在鹽處理過程中轉(zhuǎn)基因植株有更高的Na+吸收速率，這說明AtNHX1基因的表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株中Na+向液泡中的區(qū)隔化分布，從而避免了細(xì)胞質(zhì)中過量Na+對(duì)細(xì)胞的傷害。在脅

11、迫處理中轉(zhuǎn)基因植株的Na+含量要高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑模町愡_(dá)到顯著或極顯著程度。與此同時(shí)，與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)AtNHX1基因植株的葉片和根中積累了更多的Cl-和K+。這樣，轉(zhuǎn)基因植株通過無機(jī)離子的大量積累維持較低的細(xì)胞溶質(zhì)勢(shì)，在鹽脅迫下能夠較好的保持水分和維持細(xì)胞膨壓，免受或減輕了鹽脅迫造成的傷害。在鹽脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系與未轉(zhuǎn)基因株系相比具有了更高的種子萌發(fā)率和更多的生物量，轉(zhuǎn)基因植株具備了較好的耐鹽性。本工作為我國(guó)玉米育種創(chuàng)造

12、出了優(yōu)異的新材料。 轉(zhuǎn)TsVP基因玉米株系的抗旱性分析本工作通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來自鹽芥的編碼H+-PPase的基因TsVP導(dǎo)入玉米骨干自交系魯原92和掖478中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。分子鑒定表明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，且其表達(dá)強(qiáng)度在不同株系中有差異。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株后代苗期和開花期的抗旱性分析，肯定了轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性有了明顯的提高。 在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因TsVP的表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因玉米根系的生長(zhǎng)，顯著增加了轉(zhuǎn)基

13、因植株的生物量和根冠比。如轉(zhuǎn)基因株系L1在干旱脅迫處理后，其地上部分和地下部分及其根冠比分別比經(jīng)歷同樣處理的未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗蹈?1.6％、76.4％和36.4％。發(fā)達(dá)的根系有利于植物對(duì)水分的吸收，尤其是在土壤含水量較低的情況下。較發(fā)達(dá)的根系可能是轉(zhuǎn)基因植株抗旱性提高的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。苗期抗?jié)B透脅迫檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)TsVP基因玉米植株的抗?jié)B透脅迫能力與其H+-PPase酶活性呈正相關(guān)。脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系具有較高的種子萌發(fā)率，葉片能夠保持相

14、對(duì)較高的水分含量，細(xì)胞膜損傷和膜脂過氧化程度較輕，細(xì)胞中積累了更多的可溶性糖和脯氨酸，維持了較低的溶質(zhì)勢(shì)。即TsVP基因的轉(zhuǎn)入使得轉(zhuǎn)基因玉米苗期的抗?jié)B透脅迫能力得到明顯的提高，其可能的原因是：1、植株有較發(fā)達(dá)的根系，有利于干旱條件下的水分吸收；2、干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株通過積累大量的有機(jī)溶質(zhì)，維持了較低的溶質(zhì)勢(shì)，有利于細(xì)胞保持水分，免受干旱脅迫的傷害。玉米生殖生長(zhǎng)期的抗旱性對(duì)于產(chǎn)量是至關(guān)重要的。對(duì)10葉期的大田玉米進(jìn)行了為期6周的干旱脅迫

15、處理，在脅迫處理的0、1、5、10和14天時(shí)取材測(cè)定細(xì)胞膜離子滲漏率和丙二醛含量、葉片相對(duì)含水量及可溶性總糖、脯氨酸含量等。結(jié)果與苗期進(jìn)行的滲透脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，即在脅迫處理過程中轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞內(nèi)合成了更多的可溶性物質(zhì)，使葉片保持較高的相對(duì)含水量，降低了細(xì)胞膜損傷程度。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的雌雄穗開花間隔天數(shù)ASI(anthesis-silking interval)少于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑?，差異顯著。經(jīng)歷干旱處理后，轉(zhuǎn)基因株系的穗重和粒重

16、明顯高于對(duì)照株系的，差異達(dá)到顯著或極顯著程度。其中株系L1和L4的千粒重分別比對(duì)照株系多27.6％和23.0％；Y1和Y4的則分別比對(duì)照株系多15.4％和19.0％。這些結(jié)果表明，TsVP基因的轉(zhuǎn)入可明顯提高玉米植株生殖生長(zhǎng)期的抗旱能力。 本工作首次將來自鹽芥的編碼H+-PPase的TsVP基因轉(zhuǎn)入玉米，通過轉(zhuǎn)基因植株后代的抗旱性分析肯定了H+-PPase在玉米抗旱機(jī)制中有重要作用，并且獲得了干旱脅迫后產(chǎn)量明顯高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩?/p>