RET基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其體外定點(diǎn)突變.pdf

1、本研究著眼于反向論證，即構(gòu)建RET真核表達(dá)載體，完成體外定點(diǎn)突變，獲得激活的癌基因，并理論分析癌基因產(chǎn)物改變。 實(shí)驗(yàn)方法： (1)采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建RET真核表達(dá)載體pcDNA3.0-RET。利用Hand Ⅲ及Not Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶，分別消化PSK-RET及pcDNA3.0空質(zhì)粒，獲得目的基因及相應(yīng)載體后，通過T4連接酶重組DNA。通過Amp抗性、酶切鑒定及DNA序列分析，確定陽性克隆。 (2)利用

2、PCR誘導(dǎo)突變的方法完成RET體外定點(diǎn)突變。設(shè)計(jì)與合成包含突變位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增目的質(zhì)粒。Dpn Ⅰ酶消化原始模板，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，采用Amp抗性、PCR擴(kuò)增及DNA序列分析，確定突變菌株。 (3)利用OMIGA2.0蛋白分析軟件，依據(jù)突變前后RETcDNA序列對Ret蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)及蛋白性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： (1)成功構(gòu)建了RET真核表達(dá)載體pcDNA3.0-RET。 (2)成功