Taq DNA聚合酶的改造及應(yīng)用.pdf

1、本論文對(duì)Taq DNA聚合酶展開了研究，從Taq DNA聚合酶表達(dá)載體出發(fā)，對(duì)其進(jìn)行定向改造，分別用于探針檢測(cè)PCR體系和焦磷酸水解激活的聚合酶反應(yīng)(PAP)技術(shù)，最后制備其抗體達(dá)到熱啟動(dòng)PCR的目的。 第一章，概述了Taq DNA聚合酶在PCR中的應(yīng)用，普通Taq DNA聚合酶雖然得到廣泛使用，但是仍然存在不足。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室針對(duì)Taq DNA聚合酶的不足進(jìn)行了不同形式的改造，以降低或消除酶的5'→3'核酸外切酶活性，提高酶的續(xù)

2、進(jìn)性、忠實(shí)性、特異性和耐熱性等。 第二章，我們也通過定點(diǎn)突變和缺失突變的方法在基因水平對(duì)Taq DNA聚合酶進(jìn)行改造，以消除酶的5'→3'核酸外切酶活性和降低Taq DNA聚合酶對(duì)ddNTP的抵抗，并對(duì)改造后的酶蛋白進(jìn)行表達(dá)純化。 第三章，將改造的酶進(jìn)行了各方面的應(yīng)用。第一，應(yīng)用于探針檢測(cè)實(shí)時(shí)PCR體系。在各種基于探針檢測(cè)的實(shí)時(shí)PCR體系中，使用普通的Taq DNA聚合酶，有時(shí)看不到S型信號(hào)升起，在PCR循環(huán)的開始，

3、探針的熒光信號(hào)本底就很高。我們將改造后的酶應(yīng)用于探針檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)可以很好地解決這一問題，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了初始熒光信號(hào)本底高是由于探針的熒光基團(tuán)被具有5'→3'核酸外切酶活性的Taq DNA聚合酶酶切造成。第二，應(yīng)用于PAP技術(shù)。PAP技術(shù)即焦磷酸水解激活的聚合酶反應(yīng)技術(shù)。在PAP反應(yīng)體系中，應(yīng)用普通的Taq DNA聚合酶無法進(jìn)行突變的檢測(cè)，我們改造后的Taq-FS DNA聚合酶，可以成功地解決這一問題，進(jìn)行稀有突變的檢測(cè)，可以區(qū)分單堿基