人親磷酸酯酶A1基因的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、第一部分人親磷酸酯酶A1基因的克隆及序列分析
　　目的: 克隆人親磷酸酯酶A1(phosphatidic acid-preferring phospholipase A1,PA-PLA1)基因,獲mRNA全長序列,并通過分析所編碼氨基酸的序列特征為從分子水平上研究PA-PLA1生理功能提供理論依據。
　　方法: 從人的肝臟組織中提取RNA,逆轉錄為cDNA。PCR擴增該基因片段,cDNA末端快速擴增技術擴增該基因末端,克隆測

2、序后獲得PA-PLA1基因mRNA全長序列。Vector NTI8.0拼接序列并進行序列比對,DNASTAR構建系統(tǒng)樹。登錄NCBI用人類基因組數據庫做BLAST分析,ORF finder預測PA-PLA1的編碼框。
　　結果: PA-PLA1基因mRNA全長為2923bp,編碼區(qū)長2238bp,編碼一個由745個氨基酸殘基組成的蛋白多肽,分子量為83141道爾頓,等電點為5.64。全序列與人脂肪酶家族序列差異較大,與具有膜泡運輸

3、功能的KIAA0725蛋白及P125蛋白具一定同源性。氨基酸序列中具有與酶活性相關的保守序列Ser408-His-Ser410-Leu-Gly412,Glu448-Ala475區(qū)可形成卷曲螺旋區(qū)域,且N末端可形成DDHD結構域。
　　結論: 成功克隆人PA-PLA1基因(NCBI GeneBank序列號為DQ315474)。序列分析研究顯示人PA-PLA1的功能可能與細胞內信號傳導有關。
　　第二部分 PA-PLA1基因表達

4、與胰島素分泌關系的初步研究
　　目的: 研究PA-PLA1基因在小鼠胰島β細胞株MIN6中的表達與胰島素分泌的關系。
　　方法: 以不同濃度及不同時間分別對MIN6細胞行葡萄糖刺激胰島素分泌實驗,放免法測定細胞上清液中胰島素分泌量,實時熒光定量PCR檢測相應條件下PA-PLA1 mRNA的表達水平,線性相關分析PA-PLA1 mRNA表達水平與胰島素分泌的相關性。
　　結果: 在一定葡萄糖濃度范圍內,PA-PLA1 m